シリカ誘導性プロモーターを用いたThermus thermophilusの新規遺伝子発現ベクターの開発

Development of a new gene expression vector for Thermus thermophilus using a silica-inducible promoter.

• Yasuhiro Fujino
• Shuichiro Goda
• Yuri Suematsu
• Katsumi Doi

抄録

背景:

耐熱性酵素は、研究やバイオエンジニアリングの目的で、一般的に中親水性宿主で生産されている。しかし、このような宿主では、生物学的に機能するいくつかの熱酵素の活性型を過剰発現させることができない。そのため、効率的な好熱性発現系が必要とされている。Thermus thermophilusは容易に操作可能なゲノムを有しているため、「ホット」発現系の最良の候補微生物の一つである。私たちはこれまでに、過飽和シリカ条件下でT. thermophilusを活性化する強力で誘導性の高いプロモーターを同定してきました。ここでは、T. thermophilusにおけるシリカ誘導性プロモーターをベースとした新しい異種遺伝子発現系を報告する。

BACKGROUND: Thermostable enzymes are commonly produced in mesophilic hosts for research and bioengineering purposes. However, these hosts do not overexpress the active forms of some biologically functional thermoenzymes. Therefore, an efficient thermophilic expression system is needed. Thermus thermophilus contains an easily manipulable genome and is therefore among the best candidate microbes for a "hot" expression system. We previously identified a strong and inducible promoter that was active in T. thermophilus under supersaturated silica conditions. Here, we report a new heterologous gene expression system based on a silica-inducible promoter in T. thermophilus.

結果:

耐熱性β-ガラクトシダーゼをコードするThermus sp. A4遺伝子をレポーター遺伝子として発現ベクターpSix1にクローニングした。SDS-PAGEの結果、β-ガラクトシダーゼの73kDaに対応する顕著なバンドが確認され、この酵素はThermusでは活性な可溶性タンパク質（収量27mg/L）として発現したが、大腸菌では包接体として発現した。また、Thermus発現ベクターのシリカ誘導性プロモーター領域を切り詰めることで、相同組換えによるプラスミドの不安定化を回避し、目的タンパク質の収量を向上させることができた。最後に、pSix1バックボーンとシリカ誘導性プロモーターに対応する100bpのDNA領域を含む発現ベクターを開発した。このベクターを用いて、Pyrobaculum islandicum (PisGDH)のグルタミン酸脱水素酵素活性型を無処理で発現させることに成功した（収量：9.5mg/L）が、大腸菌での活性型PisGDHの発現には熱処理が必要であった。

RESULTS: A Thermus sp. A4 gene encoding thermostable β-galactosidase was cloned as a reporter gene into the expression vector pSix1, which contains a selection marker that confers thermostable resistance to hygromycin and a 600 bp DNA region containing a putative silica-inducible promoter. β-galactosidase activity was 11-fold higher in the presence than in the absence of 10 mM silicic acid. SDS-PAGE revealed a prominent band corresponding to 73 kDa of β-galactosidase, and this enzyme was expressed as an active and soluble protein (yield: 27 mg/L) in Thermus but as an inclusion body in Escherichia coli. Truncation of the putative silica-inducible promoter region in Thermus expression vector improved the yield of the target protein, possibly by avoiding plasmid instability due to homologous recombination. Finally, we developed an expression vector containing the pSix1 backbone and a 100 bp DNA region corresponding to the silica-inducible promoter. We used this vector to successfully express the active form of glutamate dehydrogenase from Pyrobaculum islandicum (PisGDH) without additional treatment (yield: 9.5 mg/L), whereas the expression of active PisGDH in E. coli required heat treatment.

結論:

サーモエンザイムであるβ-ガラクトシダーゼおよびPisGDHを活性型および可溶型としてT. thermophilusに発現させることに成功し、この種では既知の最高レベルのタンパク質発現量を達成した。これらの熱酵素は活性型および可溶型で発現していた。これらの結果は、我々のシリカ誘導性発現システムを、耐熱性タンパク質の細胞内過剰発現のための新しい戦略として使用することを検証するものである。

CONCLUSION: We successfully expressed the thermostable β-galactosidase and PisGDH in T. thermophilus as active and soluble forms and achieved with our system the highest known protein expression levels in this species. These thermoenzymes were expressed in active and soluble forms. Our results validate the use of our silica-inducible expression system as a novel strategy for the intracellular overexpression of thermostable proteins.