蛋白質の構造を電子線トモグラフィーのための低温一分子蛍光アノテーションにより明らかにした

Cryogenic single-molecule fluorescence annotations for electron tomography reveal in situ organization of key proteins in .

• Peter D Dahlberg
• Saumya Saurabh
• Annina M Sartor
• Jiarui Wang
• Patrick G Mitchell
• Wah Chiu
• Lucy Shapiro
• W E Moerner

抄録

超解像蛍光顕微鏡と極低温電子線トモグラフィー（CET）は、生体分子の細胞内組織を探索するための強力なイメージング手法である。共有結合標識に基づく超解像蛍光顕微鏡は、特定のタンパク質を強調し、単一の蛍光分子を観察するのに十分な感度を持っていますが、細胞内の詳細なコンテクストを再現することはできません。CETは分子スケールの分解能はあるが、特異的かつ非摂動的な細胞内ラベリング技術を欠いている。ここでは、極低温での単一分子蛍光の局在をCET再構成と相関させるイメージング手法について述べる。我々のアプローチは、平均9nmの横方向の精度で単一分子の局在化を達成し、局在化のセットとCET再構成との間の相対的な登録誤差は約30nmであった。我々は、バクテリア内の3つのタンパク質の位置をアノテーションすることによって、ワークフローを説明します。McpA, PopZ, SpmXの3つのタンパク質の位置をアノテーションすることで、ワークフローを説明しています。化学受容体アレイの一部を形成するMcpAは、両方のイメージングモダリティの下で可視であることによって、検証構造として機能します。対照的に、PopZとSpmXは、CETで直接識別することはできません。一方、PopZとSpmXはCETでは直接識別できないが、細胞極の電子密度の高いリボソームが存在しない領域を埋めている。その結果、リボソームが存在しない領域にPopZが存在していることを確認した。さらに、PopZの位置を利用して、非対称な細胞分裂につながるシグナル伝達経路の一部としてPopZによって隔離された低コピーのインテグラル膜タンパク質であるSpmXの局在のコンテキストを提供する。その結果、SpmXは細胞極の片側に局在し、その範囲はPopZ領域のそれと密接に一致していることが明らかになった。

Superresolution fluorescence microscopy and cryogenic electron tomography (CET) are powerful imaging methods for exploring the subcellular organization of biomolecules. Superresolution fluorescence microscopy based on covalent labeling highlights specific proteins and has sufficient sensitivity to observe single fluorescent molecules, but the reconstructions lack detailed cellular context. CET has molecular-scale resolution but lacks specific and nonperturbative intracellular labeling techniques. Here, we describe an imaging scheme that correlates cryogenic single-molecule fluorescence localizations with CET reconstructions. Our approach achieves single-molecule localizations with an average lateral precision of 9 nm, and a relative registration error between the set of localizations and CET reconstruction of ∼30 nm. We illustrate the workflow by annotating the positions of three proteins in the bacterium : McpA, PopZ, and SpmX. McpA, which forms a part of the chemoreceptor array, acts as a validation structure by being visible under both imaging modalities. In contrast, PopZ and SpmX cannot be directly identified in CET. While not directly discernable, PopZ fills a region at the cell poles that is devoid of electron-dense ribosomes. We annotate the position of PopZ with single-molecule localizations and confirm its position within the ribosome excluded region. We further use the locations of PopZ to provide context for localizations of SpmX, a low-copy integral membrane protein sequestered by PopZ as part of a signaling pathway that leads to an asymmetric cell division. Our correlative approach reveals that SpmX localizes along one side of the cell pole and its extent closely matches that of the PopZ region.

Copyright © 2020 the Author(s). Published by PNAS.