CRISPR-Cas12aは、R-ループの非対称性を利用して二本鎖切断を形成する

CRISPR-Cas12a exploits R-loop asymmetry to form double-strand breaks.

• Joshua C Cofsky
• Deepti Karandur
• Carolyn J Huang
• Isaac P Witte
• John Kuriyan
• Jennifer A Doudna

抄録

V 型 CRISPR-Cas 干渉タンパク質は、単一の RuvC 活性部位を用いて二本鎖 DNA 基質に RNA ガイド切断を行う。これらの酵素の中で最もよく研究されているCas12aは、20ヌクレオチドのRループを形成してDNA切断を開始し、ガイドRNAが二本鎖DNA基質の1本の鎖を変位させ、DNase活性部位を配置して1本目の鎖を切断する。しかし、これまでの結晶構造や生化学的データでは、二本鎖切断を完了するために二本目の鎖がどのように切断されるのかは説明されていませんでした。ここで我々は、RループのRNA-3'側に隣接するDNAに内在する不安定性を検出し、この不安定性を利用してCas12aが2本目の鎖DNAを切断するために露出させることを発見した。興味深いことに、RループのRNA-5'側に隣接するDNAは本質的に不安定ではない。R-ループ構造のこの非対称性が、すべてのタイプV CRISPR-Casシステムの基本的な特徴であるガイドRNAアーキテクチャの均一性と単一活性部位切断メカニズムを説明することができるかもしれません。

Type V CRISPR-Cas interference proteins use a single RuvC active site to make RNA-guided breaks in double-stranded DNA substrates, an activity essential for both bacterial immunity and genome editing. The best-studied of these enzymes, Cas12a, initiates DNA cutting by forming a 20-nucleotide R-loop in which the guide RNA displaces one strand of a double-helical DNA substrate, positioning the DNase active site for first-strand cleavage. However, crystal structures and biochemical data have not explained how the second strand is cut to complete the double-strand break. Here, we detect intrinsic instability in DNA flanking the RNA-3' side of R-loops, which Cas12a can exploit to expose second-strand DNA for cutting. Interestingly, DNA flanking the RNA-5' side of R-loops is not intrinsically unstable. This asymmetry in R-loop structure may explain the uniformity of guide RNA architecture and the single-active-site cleavage mechanism that are fundamental features of all type V CRISPR-Cas systems.

© 2020, Cofsky et al.