動物由来のECMをモジュール化された高度に定義されたマトリックスに置き換える戦略

Strategy to replace animal-derived ECM by a modular and highly defined matrix.

• Yevheniia Nesterenko
• Xenia Dolde
• Marcel Leist
• Olga Mayans

抄録

現代の細胞培養に使用される多くの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、動物由来である。代替的なアプローチは、個々のマトリックスタンパク質成分の組換え生産である。この戦略のさらなる発展は、様々なＥＣＭタンパク質の機能ドメインで修飾可能な一定のコアタンパク質ポリマーを使用することである。このようにして、単一の高度に定義されたECMシステムを、多種多様な細胞タイプに使用することができる。ここではZT材料（ZT）と呼ばれるヒト筋サルコメアからの自己組織化タンパク質ドメインは、ECMを生成するこのモジュラーアプローチに適していることが示されている。我々は、フィブロネクチン10ドメイン（ZTFn10）で修飾されたZTが、神経堤細胞（NCC）ベースの毒性試験のためのコーティングとして牛血清由来のフィブロネクチンを代替することができるかどうかについて、概念実証研究で調査した。ヒトNCCは多能性幹細胞から生成され、NCC遊走アッセイ（cMINC）の自動化バージョンで使用されました。ZTFn10ではなく、無修正のコア材料（ZT）は、高い遊走活性を可能にした。ポジティブコントロールとして、ウシフィブロネクチンをコーティングした従来のcMINCセットアップを使用し、タイムラプス記録によるNCC移行の詳細な解析から、新規ECMが従来のECMの生理活性と完全に一致することが示された。最後の実験では、cMINCアッセイの様々なポジティブコントロール（PCB180、LiCl、シトカラシンD）は、従来のECMと新規ECMでほぼ同一の阻害曲線を示すことが示された。このように、従来の動物由来のタンパク質コーティングの代わりにZTベースのECMを用いてcMINCや他のバイオアッセイを実施することが可能である。

Many extracellular matrices (ECM) used for modern cell culture are derived from animals. An alternative approach is the recombinant production of individual matrix protein components. A further development of this strategy uses a constant core protein polymer that is modifiable with functional domains of various ECM proteins. This way, a single, highly defined ECM system could be used for a large variety of cell types. Self-assembling protein domains from human muscle sarcomeres, termed here ZT material (ZT), have been shown to be suitable for this modular approach of generating ECMs. We explored in a proof-of-concept study, whether ZT, modified with the fibronectin 10 domain (ZTFn10) is able to substitute bovine serum-derived fibronectin as coating for neural crest cell (NCC)-based toxicity testing. Human NCC were generated from pluripotent stem cells and used in the automated version of a NCC migration assay (cMINC). ZTFn10, but not the unmodified core material (ZT), allowed for a high migration activity. The classical cMINC setup, with bovine fibronectin coating, was used as positive control, and detailed analysis of NCC migration by time-lapse recording indicated that the novel ECM fully matched the bioactivity of the traditional ECM. A final set of experiments showed that various positive controls of the cMINC assay (PCB180, LiCl, cytochalasin D) showed nearly identical inhibition curves on the traditional and the novel ECM. Thus, the cMINC, and possibly other bioassays, can be performed with a ZT-based ECM instead of traditional animal-derived protein coatings.