きのこの細菌性ブロッチ病の原因となる種の定量的診断のための6つの多重化TaqMan-qPCRアッセイ

Six Multiplex TaqMan-qPCR Assays for Quantitative Diagnostics of Species Causative of Bacterial Blotch Diseases of Mushrooms.

• Tanvi Taparia
• Marjon Krijger
• Jennifer Hodgetts
• Marc Hendriks
• John G Elphinstone
• Jan van der Wolf

抄録

バクテリア・ブロッチは、一般的なボタン茸（）の経済的に重要な病気のグループです。病原体が農場に導入されると、中親和性の栽培条件（きのこの生産に最適な条件）では、重度の二次感染が広範囲に発生します。そのため、病原体を効率的かつタイムリーに定量的に検出することは、局所的な防除戦略の立案や病害リスクの予測に不可欠である。本研究では、現在流行している 3 種類の細菌性ブロッチ病原体である「および（まだ特定できていない）菌株（に属する）」の分子診断を可能にするリアルタイム TaqMan アッセイの開発について説明します。各病原体について、2 つの異なる遺伝子座の特定の DNA マーカーを標的としたアッセイを開発し、一次検出および二次検証を行った。開発した6つのアッセイはすべて，63株および40の他の植物病原性細菌のパネルに対して高い診断特異性と感度を示した．これらのアッセイは、検量線の直線性（0.95％以上）、増幅効率（90％以上）、増幅シグナルの大きさ（2.1％以上）によって示される良好な分析性能を示した。検出限界は、細菌培養物、症候性組織、感染したケーシング土壌、およびキノコ農場からの水サンプルにおいて効率的な定量ができるように最適化された。各標的アッセイは、２つの追加アッセイと多重化した。 は、サンプル処理中のＤＮＡの損失を考慮するために、抽出コントロールとして検出した。また、土壌中の病原性と有益性の割合を定量するために、総集団を検出した。この比率はブロッチ発生の指標となると推測される。マルチプレックスアッセイは、病気のキノコ、泥炭源、ケーシング土壌、商業生産ユニットからの水を日常的に検査することで検証され、適用されました。

Bacterial blotch is a group of economically important diseases of the common button mushroom (). Once the pathogens are introduced to a farm, mesophilic growing conditions (that are optimum for mushroom production) result in severe and widespread secondary infections. Efficient, timely and quantitative detection of the pathogens is hence critical for the design of localized control strategies and prediction of disease risk. This study describes the development of real-time TaqMan assays that allow molecular diagnosis of three currently prevalent bacterial blotch pathogens: " and (as yet uncharacterized) strains (belonging to ). For each pathogen, assays targeting specific DNA markers on two different loci, were developed for primary detection and secondary verification. All six developed assays showed high diagnostic specificity and sensitivity when tested against a panel of 63 strains and 40 other plant pathogenic bacteria. The assays demonstrated good analytical performance indicated by linearity across calibration curve (>0.95), amplification efficiency (>90%) and magnitude of amplification signal (>2.1). The limits of detection were optimized for efficient quantification in bacterial cultures, symptomatic tissue, infected casing soil and water samples from mushroom farms. Each target assay was multiplexed with two additional assays. was detected as an extraction control, to account for loss of DNA during sample processing. And the total population was detected, to quantify the proportion of pathogenic to beneficial in the soil. This ratio is speculated to be an indicator for blotch outbreaks. The multiplexed assays were successfully validated and applied by routine testing of diseased mushrooms, peat sources, casing soils, and water from commercial production units.

Copyright © 2020 Taparia, Krijger, Hodgetts, Hendriks, Elphinstone and van der Wolf.