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ラット肝細胞の凍結保存中の凍結耐性関連小麦タンパク質によるストレス誘発アポトーシスの制御
Control of stress-induced apoptosis by freezing tolerance-associated wheat proteins during cryopreservation of rat hepatocytes.
PMID: 32529603 DOI: 10.1007/s12192-020-01115-y.
抄録
凍結保存は、細胞や組織を長期保存するために使用されます。ジメチルジスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結融解ダメージから細胞を保護するために、凍結保護剤が使用されます。凍結保護剤の使用にもかかわらず、肝細胞は、物理的な損傷、機能の喪失、または細胞死を引き起こす凍結融解プロセスによって課されるストレスに敏感である。代替手段として、我々は、いくつかの組換え小麦タンパク質を凍結保護剤として使用する新しい技術を開発した。そのためには、凍結保護剤として、TaENO（エノラーゼ）、TaBAS1（2-Cysペルオキシレドキシン）、WCS120（脱水）とTaIRI-2（氷の再結晶阻害剤）を組み合わせた技術を開発しました。本研究では、これらの植物タンパク質がラット肝細胞を凍結保存中に発生する細胞死から保護するメカニズムを解明することを目的としています。その結果、DMSOで凍結保存した細胞では、アポトーシスと壊死により細胞死が起こることが明らかになった。アポトーシスは、エフェクターであるカスパーゼ-3と-7の活性化、PARPの切断、核内クロマチンの凝縮によって検出された。これらのアポトーシスは、異なる植物性タンパク質で肝細胞を凍結保存したときに抑制された。DMSOを用いた凍結保存は、ミトコンドリア経路を介したアポトーシスを活性化した。さらに、アポトーシスの小胞体経路が活性化され、シャペロンBip/GRP78のレベルが低下し、プロアポトーシス転写因子CHOPが誘導され、イニシエーターカスパーゼ12が活性化された。また、アポトーシスのミトコンドリア経路と小胞体経路の活性化は、異なる組換え蛋白質を用いて肝細胞を凍結保存した場合には抑制された。この研究は、凍結ストレス時にこれらの植物タンパク質が提供する凍結保護のメカニズムの理解を深めるものである。これらのタンパク質は天然物であり、肝細胞の凍結保存中の細胞死を減少させることができる可能性を示しています。
Cryopreservation is used for long-term storage of cells and tissues. Cryoprotectants such as dimethyl disulfoxide (DMSO) are used to protect cells against freeze-thaw damage. Despite the use of cryoprotectants, hepatocytes are sensitive to stresses imposed by freeze and thaw processes, which cause physical damage, loss of functionality, or cell death. As an alternative, we have developed new technology using several recombinant wheat proteins as cryoprotectants: TaENO (enolase), TaBAS1 (2-Cys peroxiredoxin), and a combination of WCS120 (dehydrin) with TaIRI-2 (inhibitor of ice recrystallization). This study aims to understand the mechanisms by which these plant proteins protect rat hepatocytes against cell death incurred during cryopreservation. Our analysis revealed that for cells cryopreserved with DMSO, cell death occurred by apoptosis and necrosis. Apoptosis was detected by activation of effector caspases-3 and -7, PARP cleavage, and nuclear chromatin condensation. These apoptotic events were inhibited when hepatocytes were cryopreserved with the different plant proteins. Cryopreservation with DMSO activated apoptosis through the mitochondrial pathway: the Bax/Bcl-2 protein ratio increased, mitochondrial membrane potential decreased, and initiator caspase-9 was activated. Furthermore, the endoplasmic reticulum pathway of apoptosis was activated: levels of the chaperone Bip/GRP78 decreased, pro-apoptotic transcription factor CHOP was induced, and initiator caspase-12 was activated. Activation of the mitochondrial and endoplasmic reticulum pathways of apoptosis was attenuated when hepatocytes were cryopreserved with the different recombinant proteins. This study improves understanding of mechanisms of cryoprotection provided by these plant proteins during freezing stress. These proteins are natural products and show promising potential by decreasing cell death during cryopreservation of hepatocytes.