UPLC-Q-TOF/MSを用いた血漿メタボローム解析により、ルイス腫瘍担持マウスの非小細胞肺癌に対する化合物Kushen注射による介入のメカニズムを明らかにした

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Phytomedicine.2020 Jun;76:153259. S0944-7113(20)30090-8. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153259.Epub 2020-06-02.

UPLC-Q-TOF/MSを用いた血漿メタボローム解析により、ルイス腫瘍担持マウスの非小細胞肺癌に対する化合物Kushen注射による介入のメカニズムを明らかにした

A UPLC-Q-TOF/MS-based plasma metabolomics approach reveals the mechanism of Compound Kushen Injection-based intervention against non-small cell lung cancer in Lewis tumor-bearing mice.

Huan Wu
Lina Wang
Xiang Zhan
Bin Wang
Jiawen Wu
An Zhou

PMID: 32534358 DOI: 10.1016/j.phymed.2020.153259.

抄録

背景:

漢方薬としてよく知られている Compound Kushen Injection（CKI）は、15年以上前から非小細胞肺癌（NSCLC）の治療に使用されており、その臨床的な治癒効果は有益であると考えられています。

BACKGROUND: Compound Kushen Injection (CKI), a well-known Chinese Medicine preparation, has been used to treat non-small cell lung cancer (NSCLC) for more than 15 years, and its clinical curative effect is considered to be beneficial.

ヒポテーシス/パーポーズ:

本研究は、超高速液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型質量分析法（UPLC-Q-TOF/MS）をベースとした血漿メタボロミクス法を用いて、NSCLCに対するCKIの効果とその基礎となるメカニズムを評価することを目的としています。

HYPOTHESIS/PURPOSE: This study was designed to evaluate the effects and underlying mechanisms of CKI against NSCLC using an ultra-high-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS)-based plasma metabolomics approach.

方法:

4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色および3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)色素還元アッセイを用いて、CKI処理の有無にかかわらず、A549細胞のアポトーシスおよび生存率を評価した。ルイス肺癌（LLC）肉腫の重量/体積および病理組織学的検査を用いて、NSCLCに対するCKIの抗腫瘍効果を評価した。メタボロームフィンガープリントの特徴を明らかにし、LLCマウスのCKI治療に関連する機能性バイオマーカーをスクリーニングするために、多変量データ解析とUPLC-Q-TOF/MS法を組み合わせた方法を開発し、代謝経路解析を用いてCKIの治療メカニズムを検討した。

METHODS: 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining and 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) dye reduction assay were employed to assess apoptosis and the viability of A549 cells with and without CKI treatment. The weight/volume of Lewis lung carcinoma (LLC) sarcomas and histopathological examinations were used to evaluate the anti-tumor effects of CKI against NSCLC. A UPLC-Q-TOF/MS method combined with multivariate data analysis was developed to characterize metabolomic fingerprinting and to screen functional biomarkers that are linked to the CKI treatment of LLC mice, and then metabolic pathway analysis was used to investigate the therapeutic mechanism of CKI.

結果:

DAPI染色およびMTT色素還元アッセイにより、CKIは濃度依存的にそれぞれアポトーシスを誘導し、A549細胞の増殖を抑制することが示された。CKI投与群のLLC腫瘍担持マウスの肉腫の体積と重量は、生理食塩水で処理したモデル群と比較して有意に低かった。肉腫と左肺葉の病理組織学的解析から、CKIがLLCに対して改善効果を示すことが示唆された。CKIのLLCに対する治療効果に関連する14の機能性バイオマーカーをスクリーニングし、メタボロミクス研究を用いて同定した。代謝経路を解析した結果，CKIのLLCに対する治療効果は主にグリセロリン脂質代謝，アミノ酸代謝，スフィンゴ脂質代謝に関与していることが明らかになった。また、がん特異的な代謝はグリセロリン脂質代謝が重要であることから、1-アシル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトール生合成に関与する酵素をさらに評価した。ウェスタンブロットの結果、CKIはシチジン二リン酸ジアシルグリセロ-イノシトール-3-ホスファチジル転移酵素（CDIPT）および細胞質ホスファチダーゼA2（cPLA2）の活性化、およびリゾホスファチジン酸アシル転移酵素γ（AGPAT3）の阻害により、1-アシル-sn-グリセロ-3-ホスホイノシトールの異常生合成経路を調節していることが示された。

RESULTS: DAPI staining and MTT dye reduction assays indicated that CKI-induced apoptosis and inhibited the proliferation of A549 cells, respectively, in a concentration-dependent manner. The sarcoma volumes and weights in LLC tumor-bearing mice in CKI-dosed groups were significantly lower than those in a model group, which was treated with physiological saline. Histopathological analysis of sections of sarcomas and left pulmonary lobes indicated that CKI exerts an ameliorative effect against LLC. Fourteen functional biomarkers that are related to the therapeutic effects of CKI on LLC were screened and identified using a metabolomics study. Analysis of metabolic pathways revealed that the therapeutic effects of CKI on LLC mainly involved glycerophospholipid metabolism, amino acid metabolism and sphingolipid metabolism. As glycerophospholipid metabolism is a crucial feature of cancer-specific metabolism, the enzymes that are involved in 1-acyl-sn-glycero-3-phosphoinositol biosynthesis were further evaluated. Western blotting results indicated that CKI modulated the abnormal biosynthesis pathway of 1-acyl-sn-glycero-3-phosphoinositol by activation of cytidine diphosphate-diacylglycerol-inositol 3-phosphatidyltransferase (CDIPT) and cytosolic phospholipase A2 (cPLA2), and by inhibition of lysophosphatidic acid acyltransferase gamma (AGPAT3).

結論:

本研究では、CKI が良好な抗腫瘍効果を有していること、また、UPLC-Q-TOF/MS ベースのメタボロミクス手法と生化学的レベルでのさらなる検証が、CKI の基礎的なメカニズムを解明するための有望なアプローチであることを示しました。

CONCLUSION: This study demonstrated that CKI has a favorable anti-tumor effect and that a UPLC-Q-TOF/MS-based metabolomics method in conjunction with further verifications at the biochemical level is a promising approach for investigating its underlying mechanisms.