CHANGE-seqはCRISPR-Cas9のゲノムワイドな活性に対する遺伝的およびエピジェネティックな影響を明らかにする

CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR-Cas9 genome-wide activity.

• Cicera R Lazzarotto
• Nikolay L Malinin
• Yichao Li
• Ruochi Zhang
• Yang Yang
• GaHyun Lee
• Eleanor Cowley
• Yanghua He
• Xin Lan
• Kasey Jividen
• Varun Katta
• Natalia G Kolmakova
• Christopher T Petersen
• Qian Qi
• Evgheni Strelcov
• Samantha Maragh
• Giedre Krenciute
• Jian Ma
• Yong Cheng
• Shengdar Q Tsai

抄録

現在の方法では、CRISPR-Cas9ヌクレアーゼのゲノムワイドな活性を明らかにすることができるが、Cas9の特異性を支配する原理を完全に理解するために必要なスループットにまで拡張することは容易ではない。ここでは、in vitroでCas9のゲノムワイドな活性を測定するためのスケーラブルで自動化可能なタグメンテーションに基づく方法である「circularization for high-throughput analysis of nuclease genome-wide effects by sequencing」（CHANGE-seq）について述べる。我々は、CHANGE-seq をヒト初代 T 細胞の治療に関連する 13 の遺伝子座にまたがる 110 のシングルガイド RNA 標的に適用し、201,934 のオフターゲット部位を同定し、オフターゲット活性を予測するための機械学習モデルのトレーニングを可能にしました。ゲノム全体のオフターゲット、クロマチン修飾とアクセス性、転写データを比較したところ、細胞のオフターゲット活性は、活性の高いプロモーター、エンハンサー、転写領域の近くで2～4倍の確率で発生することがわかりました。最後に、8つの個々のゲノムにまたがる6つのターゲットについてCHANGE-seq解析を行ったところ、ヒトの単一ヌクレオチドの変異が解析されたオフターゲット部位の15.2%程度で活性に有意な影響を及ぼすことが明らかになりました。CHANGE-seqは、ゲノム編集者の特異性を理解するためのシンプルで感度が高く、スケーラブルなアプローチです。

Current methods can illuminate the genome-wide activity of CRISPR-Cas9 nucleases, but are not easily scalable to the throughput needed to fully understand the principles that govern Cas9 specificity. Here we describe 'circularization for high-throughput analysis of nuclease genome-wide effects by sequencing' (CHANGE-seq), a scalable, automatable tagmentation-based method for measuring the genome-wide activity of Cas9 in vitro. We applied CHANGE-seq to 110 single guide RNA targets across 13 therapeutically relevant loci in human primary T cells and identified 201,934 off-target sites, enabling the training of a machine learning model to predict off-target activity. Comparing matched genome-wide off-target, chromatin modification and accessibility, and transcriptional data, we found that cellular off-target activity was two to four times more likely to occur near active promoters, enhancers and transcribed regions. Finally, CHANGE-seq analysis of six targets across eight individual genomes revealed that human single-nucleotide variation had significant effects on activity at ~15.2% of off-target sites analyzed. CHANGE-seq is a simplified, sensitive and scalable approach to understanding the specificity of genome editors.