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PCRとリアルタイムPCRを用いたコロナウイルス疾患2019（COVID-19）のSARS-CoV-2のプライマーセットと検出プロトコルの最適化
Optimization of primer sets and detection protocols for SARS-CoV-2 of coronavirus disease 2019 (COVID-19) using PCR and real-time PCR.
PMID: 32546849 PMCID: PMC7295692. DOI: 10.1038/s12276-020-0452-7.
抄録
SARS-CoV-2は非常に感染力が強く、世界的に急速に広がっています。様々な症状を伴う無症候性の症例や無症候性の感染の可能性があるため、無症候性の人を診断するための迅速かつ感度の高い検出プロトコルが急務となっています。SARS-CoV-2診断キットは、すでに多くの企業や国の保健機関から入手可能である。しかし、これらの診断キットに関する一般に公開されている情報は不足している。このようなニーズの高まりと情報不足に対応するために、我々は以前の研究で、低コストでアクセスが容易なリアルタイムPCR法を用いたウイルスの早期検出プロトコルを開発し、利用可能にしました。検出プロトコルの開発中に、最適化されていないプライマーセットが誤って偽陽性を示す可能性があることを発見し、市販の診断キットにも偽陽性を示すプライマーセットが含まれている可能性があることを指摘した。ここでは、特定のプライマーセットの設計と最適化のための3つのステップのガイドラインを提供します。その3つのステップとは、（1）対象ゲノム（SARS-CoV-2）中の標的遺伝子（RdRP、N、E、S）に対するプライマーセットの選択、（2）プライマーおよびアンプリコン配列のインシリコバリデーション、（3）プライマーと標的遺伝子との特異的なハイブリダイゼーションのためのPCR条件（プライマー濃度、アニーリング温度）の最適化、およびスプリアスプライマー二量体の除去である。さらに、我々は、以前に開発されたリアルタイムPCRベースのプロトコルをより従来のPCRベースのプロトコルに拡張し、RdRP、N、E、およびSのすべてのプライマーセットを1つの反応で同時にテストすることを可能にするマルチプレックスPCRベースのプロトコルを適用しています。この新たに最適化されたプロトコールは、ハイスペックな機器がなくても、無症候性の人を対象とした大規模かつ高忠実度のスクリーニング、感染のさらなる予防、そして急速に増殖するウイルスへの早期介入と治療の実現に役立つものと期待されます。
SARS-CoV-2 is very contagious and has rapidly spread globally. Due to various symptomatic and asymptomatic cases and the possibility of asymptomatic transmission, there is a pressing need for a fast and sensitive detection protocol to diagnose asymptomatic people. Various SARS-CoV-2 diagnostic kits are already available from many companies and national health agencies. However, publicly available information on these diagnostic kits is lacking. In response to the growing need and the lack of information, we developed and made available a low-cost, easy-access, real-time PCR-based protocol for the early detection of the virus in a previous study. During the development of the detection protocol, we found that unoptimized primer sets could inadvertently show false-positive results, raising the possibility that commercially available diagnostic kits might also contain primer sets that produce false-positive results. Here, we provide three-step guidelines for the design and optimization of specific primer sets. The three steps include (1) the selection of primer sets for target genes (RdRP, N, E, and S) in the genome of interest (SARS-CoV-2), (2) the in silico validation of primer and amplicon sequences, and (3) the optimization of PCR conditions (i.e., primer concentrations and annealing temperatures) for specific hybridization between the primers and target genes, and the elimination of spurious primer dimers. Furthermore, we have expanded the previously developed real-time PCR-based protocol to more conventional PCR-based protocols and applied a multiplex PCR-based protocol that allows the simultaneous testing of primer sets for RdRP, N, E, and S all in one reaction. Our newly optimized protocol should be helpful for the large-scale, high-fidelity screening of asymptomatic people, even without any high-specification equipment, for the further prevention of transmission, and to achieve early intervention and treatment for the rapidly propagating virus.