FBXO2はSTAT3シグナルを調節し、骨肉腫細胞の増殖と腫瘍性を制御している

FBXO2 modulates STAT3 signaling to regulate proliferation and tumorigenicity of osteosarcoma cells.

• Xunming Zhao
• Weichun Guo
• Lixue Zou
• Biao Hu

抄録

背景:

骨肉腫（OS）は小児・青年に最も多い原発性骨悪性腫瘍であり、細胞の増殖亢進がOSの大きな問題となっている。FBXO2 は F-box タンパク質ファミリーに属し、高マンノース糖タンパク質に特異的な Skp1-Cul1-F-box タンパク質（SCF）E3 ユビキチンリガーゼ複合体の基質認識成分である。本研究の目的は、OS細胞におけるFBXO2の重要な役割を調べることであった。

Background: Osteosarcoma (OS) is the most common primary bone malignancy in children and adolescents, and hyperproliferation of cells is a major problem of OS. FBXO2 belongs to the family of F-box proteins, and is a substrate recognition component of the Skp1-Cul1-F-box protein (SCF) E3 ubiquitin ligase complex with specificity for high-mannose glycoproteins. The aim of the present study was to investigate the critical role of FBXO2 in OS cells.

方法:

臨床的OS患者におけるFBXO2のタンパク質およびmRNA発現レベルを、それぞれ定量的実時間ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学（IHC）染色アッセイによって測定した。FBXO2過剰発現モデルは、OS細胞を用いたレトロウイルストランスフェクションにより構築した。FBXO2ノックアウト（KO）細胞は、Clustered regularly interspaced short palindromic repeat（CRISPR）-CRISPR-associated protein 9（Cas9）アッセイによって生成した。細胞計数およびコロニー形成アッセイは、OS細胞の生物学的機能に対するFBXO2の効果を分析するために使用した。FBXO2 KO細胞をヌードマウスに注入し、in vivoでの腫瘍成長を観察した。FBXO2とIL-6との相互作用を免疫沈降法で検出した。ルシフェラーゼアッセイを用いてSTAT3の転写活性を測定した。

Methods: The protein and mRNA expression levels of FBXO2 in clinic OS patients were measured by quantitative real time-polymerase chain reaction (qRT-PCR), Western blot and Immunohistochemical (IHC) staining assays, respectively. The FBXO2 overexpression model was constructed by retro-virus transfection in OS cells. FBXO2 knockout (KO) cells were generated by Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) assay. Cell counting and colony formation assays were used to analyze the effect of FBXO2 on the biological function of OS cells. FBXO2 KO cells were injected into nude mice to observe tumor growth in vivo. The interaction between FBXO2 and IL-6 was detected by immunoprecipitation. Luciferase assay was used to determine the transcriptional activity of STAT3.

結果:

ここでは、臨床的なOSサンプルにおいて、隣接する正常組織と比較してFBXO2の発現が有意に上昇していることを示している。FBXO2の異所性発現はOS細胞の増殖とコロニー形成能の増加につながるが、CRISPR-Cas9ベースの遺伝子編集によるFBXO2ノックアウトはその逆の効果を示す。さらに、FBXO2の糖タンパク質認識活性は、OSにおける生物学的機能に必要である。FBXO2をノックアウトすると、ヌードマウスのOS細胞の腫瘍性が大きく損なわれることをin vivo実験で明らかにした。分子レベルでは、FBXO2をノックアウトすることで、IL-6Rの安定化を介してSTAT3のリン酸化と下流の標的遺伝子の発現が有意に抑制されることを見出した。

Results: Here, we show that FBXO2 is significantly up-regulated in clinical OS samples compared to adjacent normal tissues. Ectopic expression of FBXO2 leads to increased OS cell proliferation and colony-forming ability, while FBXO2 knockout by CRISPR-Cas9-based gene editing has the opposite effect. In addition, the glycoprotein recognition activity of FBXO2 is required for its biological function in OS. In vivo experiments showed that FBXO2 knockout greatly impaired the tumorigenicity of OS cells in nude mice. At the molecular level, we found that knocking out FBXO2 can significantly inhibit STAT3 phosphorylation and downstream target gene expression through IL-6R stabilization.

結論:

これらの結果は、FBXO2がSTAT3シグナル伝達経路を活性化することによりOSの発症を促進することを示しており、FBXO2がOS治療の新たなターゲットとなる可能性を示唆している。

Conclusion: Together, these results indicate that FBXO2 promotes OS development by activating the STAT3 signaling pathway, suggesting that FBXO2 may be a new target for OS treatment.

© The Author(s) 2020.