iTRAQ法を用いた東洋海老のAeromonas hydrophila感染症に対する血球のプロテオミクス解析

Differentially proteomic analysis of the hemocytes against Aeromonas hydrophila infection in oriental river prawn Macrobrachium nipponense by iTRAQ approach.

• Yanhong Chang
• Chunguang Yin
• Hao Peng
• Yanqiu Shi

抄録

生体機能の直接的な実行者として、宿主におけるタンパク質の発現レベルを知ることで、細菌の感染を制御する分子機構がより直接的に明らかになると考えられます。本研究では、Aeromonas hydrophila 感染に応答する Macrobrachium nipponense 血球のプロテオームを、液体クロマトグラフィー エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法を用いて同位体タグ相対定量法（iTRAQ）を用いて同定した。A. hydrophila に感染していないエビと A. hydrophila に感染したエビ M. nipponense の感染後 12 時間、24 時間、36 時間後の血球タンパク質を比較した。その結果、合計で3372個のタンパク質が同定され、1014個のタンパク質が異なる発現をしていると考えられ、そのうち117個のタンパク質が共通して異なる発現をしていることが示された。また、階層的クラスタリング、Gene Ontology、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment、蛋白質-蛋白質相互作用ネットワーク解析を行い、全体的に濃縮された蛋白質の特徴を明らかにした。その結果、ミオシン重鎖、ミオシン調節性軽鎖、アクチン、チューブリンα/β鎖、トロポニンI、トロポニンTなどの細胞骨格蛋白質、カタラーゼや細胞質性MnSODなどの抗酸化酵素が血球中で有意に高発現していることがわかった。また、インテグリンβ、インネキシンinx2-like、ヒートショックプロテイン60などの他のタンパク質も細菌に対するエビの免疫応答に関与していることが明らかになった。また、異なるタンパク質の発現量を検証するためにパラレルリアクションモニター解析を実施し、プロテオーム解析結果の信頼性の高さを確認した。本研究は、A. hydrophila感染症に対するM. nipponense血球のプロテオームに関する初めての報告であり、エビの分子メカニズムの解明に貢献するものである。

As the direct executors of biological function, the expression level of proteins in host will reveal the molecular mechanisms regulating bacteria infection more directly. In the present study, the differential proteomes of Macrobrachium nipponense hemocytes response to Aeromonas hydrophila infection were identified with isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) labeling followed by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. The hemocyte proteins from the unchallenged and A. hydrophila challenged prawn, M. nipponense, at 12, 24 and 36 h post infection were compared. From this, a total of 3372 proteins were identified and 1014 proteins were considered differentially expressed, of which 117 common differentially expressed proteins were indicated between the time points. Hierarchical clustering, Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment and protein-protein interaction network analyses were performed for the general characterization of overall enriched proteins. Cytoskeletal proteins including myosin heavy chain, myosin regulatory light chain, actin, tubulin alpha/beta chain, troponin I and troponin T as well as antioxidant enzymes such as catalase and cytosolic MnSOD were found significantly up-regulated in hemocytes, indicating that the phagocytosis process and ROS system were induced after challenge with A. hydrophila. And other proteins such as integrin β, innexin inx2-like and heat shock protein 60 also participate in prawn immune response against bacteria. Parallel reaction monitoring analyses were carried out for validation of the expression levels of differentially expressed proteins, which indicated high reliability of the proteomic results. This is the first report on proteome of M. nipponense hemocytes against A. hydrophila infection, which contributes to better understanding on the molecular mechanisms of prawns.

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