3種のインターフェロンアンタゴニストを不活性化することで、腸管コロナウイルスの病原性を減衰させる

Inactivating Three Interferon Antagonists Attenuates Pathogenesis of an Enteric Coronavirus.

• Xufang Deng
• Alexandra C Buckley
• Angela Pillatzki
• Kelly M Lager
• Kay S Faaberg
• Susan C Baker

抄録

コロナウイルス（CoV）は、野生動物を宿主とする動物からヒトや家畜に繰り返し出現し、重大な罹患率や死亡率を伴う伝染病を引き起こしています。新たに出現した SARS-CoV-2 に代表されるように、CoV は呼吸器系や腸管系を含むさまざまな臓器に感染します。しかし、腸管疾患の発症に寄与するウイルス因子の組み合わせについては、未だ解明されていない。ここでは、CoVインターフェロンアンタゴニストが腸管疾患の発症に寄与するかどうかを調べた。腸性CoVである豚伝染性下痢ウイルス（icPEDV）の感染性クローンを用いて、インターフェロンアンタゴニスト非構造タンパク質1、15および16の不活性版を個別に、または組み合わせて、1つのウイルス内にicPEDV-mut4と命名したウイルスを作製した。インターフェロン応答性PK1細胞をこれらのウイルスに感染させたところ、野生型のicPEDV感染と比較して、より高いレベルのインターフェロン応答を産生した。ウイルスの病原性を評価するために、子豚を icPEDV または icPEDV-mut4 のいずれかに感染させた。icPEDVに感染した子豚は臨床症状を示したが、icPEDV-mut4に感染した子豚は臨床症状を示さず、感染後2日目には正常な腸内病理を示した。icPEDV-mut4 は腸管内で複製され、糞便スワブ中のウイルス RNA の検出により明らかになりました。重要なことは、icPEDV-mut4感染はPEDVに対するIgGおよび中和抗体反応を誘発したことです。これらの結果から、豚における PEDV 誘発性下痢症の発症に寄与する病原性因子として nsp1、nsp15、および nsp16 が同定された。これらの CoV インターフェロンアンタゴニストを不活性化することは、SARS-CoV-2 を含む腸管性 CoV の疾病および蔓延を予防するための候補ワクチンを作成するための合理的なアプローチである。SARS-CoV-2およびブタのCoVを含む新興のコロナウイルスは、腸球に感染し、下痢を引き起こし、糞便中に排出されることがある。腸管病原体を理解し、これらのウイルスの拡散を防ぐためのワクチンや治療法を開発するためには、新たなアプローチが必要である。本研究では、腸内感染性CoVである豚伝染性下痢ウイルス（PEDV）の逆遺伝学的システムを利用し、感染に対する宿主の自然免疫反応を制限することが知られている保存性の高いウイルス因子を遺伝子的に不活性化するアプローチを概説しています。我々の研究では、3種類のウイルス性インターフェロンアンタゴニストである非構造タンパク質1、15、16の不活性バージョンを用いてPEDVを生成すると、動物では下痢を引き起こさない高度に減衰したウイルスが得られ、ウイルス感染動物では中和抗体反応が誘発されることが明らかになった。この戦略は、SARS-CoV-2を含む腸性CoVの疾病および糞便伝播を防止する生きた減衰ワクチン候補を生成するために有用である可能性がある。

Coronaviruses (CoVs) have repeatedly emerged from wildlife hosts into humans and livestock animals to cause epidemics with significant morbidity and mortality. CoVs infect various organs including respiratory and enteric systems, as exemplified by the newly emerged SARS-CoV-2. The constellation of viral factors that contribute to developing enteric disease remains elusive. Here, we investigated CoV interferon antagonists for their contribution to enteric pathogenesis. Using an infectious clone of an enteric CoV, porcine epidemic diarrhea virus (icPEDV), we generated viruses with inactive versions of interferon antagonist nonstructural proteins 1, 15, and 16 individually, or combined in one virus designated icPEDV-mut4. Interferon-responsive PK1 cells were infected with these viruses and produced higher levels of interferon responses, as compared to wild-type icPEDV infection. icPEDV-mut4 elicited robust interferon responses and was severely impaired for replication in PK1 cells. To evaluate viral pathogenesis, piglets were infected with either icPEDV or icPEDV-mut4. While the icPEDV-infected piglets exhibited clinical disease, the icPEDV-mut4-infected piglets showed no clinical symptoms and exhibited normal intestinal pathology at day 2 post-infection. The icPEDV-mut4 replicated in the intestinal tract, as revealed by detection of viral RNA in fecal swabs, with sequence analysis documenting genetic stability of the input strain. Importantly, icPEDV-mut4 infection elicited IgG and neutralizing antibody responses to PEDV. These results identify nsp1, nsp15, and nsp16 as virulence factors that contribute to the development of PEDV-induced diarrhea in swine. Inactivating these CoV interferon antagonists is a rational approach for generating candidate vaccines to prevent disease and spread of enteric CoVs, including SARS-CoV-2. Emerging coronaviruses, including SARS-CoV-2 and porcine CoVs, can infect enterocytes, cause diarrhea, and be shed in the feces. New approaches are needed to understand enteric pathogenesis and develop vaccines and therapeutics to prevent the spread of these viruses. Here, we exploit a reverse genetic system for an enteric CoV, porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and outline an approach of genetically inactivating highly conserved viral factors known to limit the host innate immune response to infection. Our study reveals that generating PEDV with inactive versions of three viral interferon antagonists, nonstructural proteins 1, 15 and 16, results in a highly attenuated virus that does not cause diarrhea in animals, and elicits a neutralizing antibody response in virus-infected animals. This strategy may be useful for generating live-attenuated vaccine candidates that prevent disease and fecal spread of enteric CoVs, including SARS-CoV-2.

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