ウシ脳シナプトソームにおけるチアミン一リン酸ホスファターゼおよび二リン酸ホスファターゼ

Thiamine Mono- and Diphosphate Phosphatases in Bovine Brain Synaptosomes.

• V A Aleshin
• O A Mezhenska
• Y M Parkhomenko
• T Kaehne
• V I Bunik

抄録

神経変性疾患には、チアミンモノホスファターゼや二リン酸ホスファターゼの活性変化が関与しているが、これらの哺乳類酵素の分子同定は不完全である。本研究では、ウシ脳シナプトソームからチアミン誘導体に対するホスファターゼ活性を示すタンパク質画分を、チアミン-セファロース上でアフィニティークロマトグラフィーに供した。チアミン（pH7.4または5.6）、NaClおよび尿素で溶出したタンパク質画分を、チアミン一リン酸（ThMP）、チアミン二リン酸（ThDP）および構造的に類似したプリンヌクレオチドに対するホスファターゼ活性についてアッセイした。ウシゲノムのアノテーションが不十分であったため、各画分中のタンパク質をSwissProtデータベースを用いた全生物の質量分析により同定した。2つのアノテーションされた細菌性ホスファターゼ、DINGタンパク質ファミリーからのアルカリホスファターゼLとエキソポリホスファターゼのペプチドが酸性チアミン溶出液中で同定された。溶出画分中のアルカリホスファターゼLとエキソポリホスファターゼのペプチドの存在量は、それぞれThMPaseとThDPase活性と相関していた。ThMPase及びThDPase活性の溶出プロファイルは、ヌクレオチドホスファターゼの溶出プロファイルとは異なっており、これらの酵素のチアミン誘導体に対する特異性が示唆された。チアミン-セファロースからの溶出物中の哺乳類DINGホスファターゼの探索は、X-DING-CD4を明らかにし、ほとんどが酸性のチアミン溶液（pH5.6）によって溶出した。また、同定されたエキソポリホスファターゼは、ThDPase活性を有するアピラーゼと構造的に類似していた。この結果から、哺乳類のDINGタンパク質はThMPase活性を、アピラーゼはThDPase活性を示すことが明らかになった。

Neurodegenerative diseases are accompanied by changes in the activity of thiamine mono- and diphosphate phosphatases, but molecular identification of these mammalian enzymes is incomplete. In this work, the protein fraction of bovine brain synaptosomes displaying phosphatase activity toward thiamine derivatives was subjected to affinity chromatography on thiamine-Sepharose. Protein fractions eluted with thiamine (pH 7.4 or 5.6), NaCl, and urea were assayed for the phosphatase activity against thiamine monophosphate (ThMP), thiamine diphosphate (ThDP), and structurally similar purine nucleotides. Proteins in each fraction were identified by mass spectrometry using the SwissProt database for all organisms because of insufficient annotation of the bovine genome. Peptides of two annotated bacterial phosphatases, alkaline phosphatase L from the DING protein family and exopolyphosphatase, were identified in the acidic thiamine eluate. The abundance of peptides of alkaline phosphatase L and exopolyphosphatase in the eluted fractions correlated with ThMPase and ThDPase activities, respectively. The elution profiles of the ThMPase and ThDPase activities differed from the elution profiles of nucleotide phosphatases, thus indicating the specificity of these enzymes toward thiamine derivatives. The search for mammalian DING phosphatases in the eluates from thiamine-Sepharose revealed X-DING-CD4, mostly eluted by the acidic thiamine solution (pH 5.6). The identified exopolyphosphatase demonstrated structural similarity with apyrases possessing the ThDPase activity. The obtained results demonstrate that mammalian DING proteins and apyrases exhibit ThMPase and ThDPase activity, respectively.