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分子環化によるルーメン微生物叢からのキシラナーゼの耐熱性の向上
[Enhancing thermostability of xylanase from rumen microbiota by molecular cyclization].
PMID: 32567275 DOI: 10.13345/j.cjb.190341.
抄録
熱耐性の能力は、工業用酵素にとって極めて重要である。過去10年間、遺伝子工学およびタンパク質工学戦略を用いて、野生型酵素により高い触媒活性または耐熱性を付与するための多大な努力がなされてきた。この研究では、最近開発されたSpyTag/SpyCatcherシステムを、イソペプチド結合ライゲーションを媒介として、ルーメン微生物由来のキシラナーゼXYN11-6を、環化された安定な酵素C-XYN11-6として改変するために使用した。60、70または80℃で10分間インキュベートした後、C-XYN11-6の残存活性は81.53％、73.98％または64.41％であり、それぞれ線状酵素L-XYN11-6の1.48倍、2.92倍または3.98倍であった。60〜90℃に10分間曝露した後、C-XYN11-6は懸濁液中で可溶性のままであったが、L-XYN11-6は深刻な凝集を示した。C-XYN11-6はL-XYN11-6と比較して、熱負荷時の構造維持能力が高いことが明らかになった。興味深いことに、分子環化により、C-XYN11-6は0.1～50 mmol/L Ca²⁺または0.1 mmol/L Cu²⁺処理に対する耐性が改善されました。以上のことから、SpyTag/SpyCatcherシステムを用いて、熱的・イオン的に安定な環化酵素を作製し、産業応用のための酵素工学に応用することができた。
The capacity for thermal tolerance is critical for industrial enzyme. In the past decade, great efforts have been made to endow wild-type enzymes with higher catalytic activity or thermostability using gene engineering and protein engineering strategies. In this study, a recently developed SpyTag/SpyCatcher system, mediated by isopeptide bond-ligation, was used to modify a rumen microbiota-derived xylanase XYN11-6 as cyclized and stable enzyme C-XYN11-6. After incubation at 60, 70 or 80 ℃ for 10 min, the residual activities of C-XYN11-6 were 81.53%, 73.98% or 64.41%, which were 1.48, 2.92 or 3.98-fold of linear enzyme L-XYN11-6, respectively. After exposure to 60-90°C for 10 min, the C-XYN11-6 remained as soluble in suspension, while L-XYN11-6 showed severely aggregation. Intrinsic and 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS)-binding fluorescence analysis revealed that C-XYN11-6 was more capable of maintaining its conformation during heat challenge, compared with L-XYN11-6. Interestingly, molecular cyclization also conferred C-XYN11-6 with improved resilience to 0.1-50 mmol/L Ca²⁺ or 0.1 mmol/L Cu²⁺ treatment. In summary, we generated a thermal- and ion-stable cyclized enzyme using SpyTag/SpyCatcher system, which will be of particular interest in engineering of enzymes for industrial application.
在高温下保持催化活性是工业酶的重要性质。近年来，采用基因工程、蛋白质工程技术提高野生酶进行催化活性或耐热等性质取得了重要进展。文中利用新近建立起来的异肽键介导的SpyTag/SpyCatcher 系统对瘤胃微生物来源的木聚糖酶XYN11-6 进行分子环化，获得稳定的环化酶C-XYN11-6。70 ℃和80 ℃下处理10 min，C-XYN11-6 的残余活性为81.53%、73.98%和64.41%，分别是相同线条件下性蛋白L-XYN11-6 残余活性的1.48、2.92、3．98 倍。经60-90 ℃热处理10分后，C-XYN11-6 仍保持可溶状态，而L-XYN11-6 几乎完全聚沉。内源荧光和8苯胺-1-"LoHan_8418"磺酸（8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸、ANS）结果合荧光谱分析显示，较之L-XYN11-6，热处理环境中C-XYN11-6 更能够维持其构象稳定。值得注意的是，分子环化提高了C-XYN11-6 对0.1〜50 mmol/L Ca²⁺或は0．1 mmol/L Cu²⁺的耐受能力。综上所述，文中利用SpyTag/SpyCatcher 系统获得热稳定性离和子稳定性提高的环化酶，为工业的酶分子改良及扩大其在工业领域的应用建立了良好基础。
在高温下保持催化活性是工业酶的重要性质。近年来，采用基因工程、蛋白质工程技术提高野生酶进行催化活性或耐热等性质取得了重要进展。文中利用新近建立起来的异肽键介导的SpyTag/SpyCatcher 系统对瘤胃微生物来源的木聚糖酶XYN11-6 进行分子环化，获得稳定的环化酶C-XYN11-6。在60 ℃、70 ℃和80 ℃下处理10 min，C-XYN11-6 的残余活性为81.53%、73.98%和64.41%，分别是相同条件下线性蛋白L-XYN11-6 残余活性的1.48、2.92、3.98 倍。经60–90 ℃热处理10 min 后，C-XYN11-6 仍保持可溶状态，而L-XYN11-6 几乎完全聚沉。内源荧光和8-苯胺-1-萘磺酸 (8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS) 结合荧光光谱分析显示，较之L-XYN11-6，热处理环境中C-XYN11-6 更能够维持其构象稳定。值得注意的是，分子环化提高了C-XYN11-6 对0.1–50 mmol/L Ca²⁺或0.1 mmol/L Cu²⁺的耐受能力。综上所述，文中利用SpyTag/SpyCatcher 系统获得热稳定性和离子稳定性提高的环化酶，为工业酶的分子改良及扩大其在工业领域的应用建立了良好基础。.