次世代シークエンシングによる都市下水中のエンテロウイルスの検出と環境監視への応用

Detection of enteroviruses in urban sewage by next generation sequencing and its application in environmental surveillance.

• Zexin Tao
• Peng Chen
• Ning Cui
• Xiaojuan Lin
• Feng Ji
• Yao Liu
• Ping Xiong
• Li Zhang
• Qing Xu
• Yanyan Song
• Aiqiang Xu

抄録

エンテロウイルス（EV）の循環監視には環境監視法が用いられてきたが、細胞培養法は環境から回収されたEV株に選択的なバイアスを導入する可能性がある。本研究では、2018年に中国済南市で毎月収集した都市下水サンプルを膜吸着・溶出法で濃縮した。下水濃縮物からEVのP1領域全体をカバーする4000ヌクレオチド長のアンプリコンを取得し、次世代シークエンシング（NGS）でさらに解析するP1セミステッドRT-PCR（RT-snPCR）法とNGS法を開発した。さらに、各下水濃縮物について、細胞培養とNGSによる部分的なVP1アンプリコンシークエンシングの2つのアッセイを並行して実施し、比較した。その結果，P1 RT-snPCR法とNGS法では，最も多くのデータが得られ，EV-A（n=11），EV-B（n=14），EV-C（n=7）に属する32の血清型が同定された．これらの血清型は、細胞培養法（n=10）および部分的VP1アンプリコンシークエンシング法（n=16）で検出された血清型をすべて網羅していた。急性弛緩性麻痺のサーベイランスから検出されたEVの血清型は下水から検出された血清型と相関していた。髄膜炎の一般的な病原体であるコックスサッキーウイルスB5の系統解析を行ったところ、環境配列と臨床配列の間には密接な遺伝的関係があることが明らかになった。これらの結果は、下水には様々な疾患に関連する異なるEVが含まれていることを示している。従来の細胞培養法では、いくつかの血清型の存在を過小評価していた。NGSを用いた環境サーベイランスは、臨床疾患のデータと一致したデータを提供し、集団における実際の循環の理解を飛躍的に向上させるものであり、公衆衛生サーベイランスのために奨励されるべきものである。

Environmental surveillance has been used successfully in monitoring enterovirus (EV) circulation; however cell culture method may introduce a selective bias in those EV strains that are recovered from the environment. In this study, urban sewage samples were collected monthly in Jinan, China in 2018 and concentrated via membrane adsorption/elution method. A P1 seminested RT-PCR (RT-snPCR) and NGS method was developed, by which amplicons of 4000 nucleotide in length covering the entire P1 region of EVs were obtained from sewage concentrates and were further analyzed by next generation sequencing (NGS). In addition, for each sewage concentrate, two other assays - cell culture and NGS based partial VP1 amplicon sequencing - were conducted in parallel and compared. The results showed that the P1 RT-snPCR and NGS method generated the most data, with 32 serotypes identified belonging to species EV-A (n = 11), EV-B (n = 14), and EV-C (n = 7). These serotypes covered all those detected from the methods of cell culture (n = 10) and partial VP1 amplicon sequencing (n = 16). EV serotypes from acute flaccid paralysis surveillance correlated with those from sewage. Phylogenetic analysis on coxsackievirus B5, a common pathogen of meningitis, revealed close genetic relationship between environmental and clinical sequences. These results demonstrate sewage contains different EVs related to a variety of diseases. Traditional cell culture method underestimates the existence of some serotypes. NGS based environmental surveillance provides data which are consistent with those from clinical diseases, greatly improves our understanding on the actual circulation in the population, and should be encouraged for public health surveillance.

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