バイオサンプル中のペルオキシダーゼとアスコルビン酸の同時定量を、Fe(iii)/メチルチモールブルーカーボンドット模擬酵素をベースとした自動化システムで実現しました

Simultaneous quantification of peroxidase and ascorbic acid in biosamples with an automatic system based on a Fe(iii)/methylthymol blue-carbon dot simulative enzyme.

• Yang Zhao
• Qiao-Jing Li
• Yong-Sheng Li
• Xiu-Feng Gao

抄録

ペルオキシダーゼ（POD）とアスコルビン酸（AsA）は、通常、生物を活性酸素障害から守るために生物内に共存しており、その含有量は異なる生理条件下で動的に変化します。また、POD 触媒活性の分光光度法での応答は、AsA と POD 触媒から得られる発色生成物との間に消光反応があることを発見したため、AsA の含有量で補正する必要がありました。以上のことから、グアイアコール/POD/H2O2反応における発色現象と消光現象を巧みに利用して、フローインジェクション分析（FIA）によるPOD（73-440 U L-1）とAsA（4-60 mg L-1）の同時定量のための自動分析システムを確立することに成功しました。さらに、酸性条件下（0.5 mol L-1のHCl）で、水熱合成（250℃、1時間）を行い、PODの模擬酵素であるメチルチモールブルー（0.08 g L-1）／FeCl3（0.8 g L-1）の新規カーボンドット（sPOD-CDs）を合成し、FIAシステム内でのグアイアコール/H2O2反応の触媒に初めて使用し、失活反応における天然HRPの代替として使用しました。このsPOD-CD溶液はバックグラウンド吸収がなく、その濃度は模擬POD活性と優れた相関を示します。最後に、最適化後、このFIAシステムを利用して、AsAの還元性がアスコルビン酸イオンによるものであることを検証し、いくつかの植物サンプル中のPODとAsAを決定した。標準添加回収実験では、実際のサンプルではマトリックスの干渉はなく（回収率95%～105%）、得られたPODとAsAの結果も参考実験と一致していた（相対偏差≦2.80%、t検定≧0.07）。提案したFIAシステムは、高いサンプルスループット(40サンプル/h)、より優れた再現性(相対標準偏差≦1.4%)などの特徴を有している。

Peroxidase (POD) and ascorbic acid (AsA) usually coexist in organisms to synergistically protect them from reactive oxygen damage, and their contents undergo dynamic changes under different physiological conditions. What's more, the response of POD-catalytic activity in spectrophotometry has to be corrected using the content of concomitant AsA because we found that there is an extinction reaction between AsA and chromogenic products obtained from POD catalysis. With these implications, by skilfully using the chromogenic and the extinction phenomena in the guaiacol/POD/H2O2 reaction, an automatic analysis system for simultaneous quantification of POD (73-440 U L-1) and AsA (4-60 mg L-1) was successfully established based on flow injection analysis (FIA). Furthermore, under acidic conditions (0.5 mol L-1 of HCl), hydrothermal synthesis (250 °C for 1 h) was used for synthesizing new carbon dots (sPOD-CDs) of methylthymol blue (0.08 g L-1)/FeCl3 (0.8 g L-1), which is a simulative enzyme for POD, and it was first used for catalyzing the guaiacol/H2O2 reaction within the FIA system to replace natural HRP in the extinction reaction. This sPOD-CD solution has no background absorption and its concentration shows excellent correlation with simulative POD-activity. Finally, after optimization, this FIA system was utilized to testify that the reducibility of AsA is due to ascorbate ions and to determine POD and AsA in some plant samples. The standard addition recovery experiment showed that there was no interference from the matrix in real samples (recoveries: 95%-105%), and the obtained POD and AsA results were also consistent with the reference experiments (relative deviation ≤ 2.80%, t-test ≥ 0.07). The proposed FIA system is characterized by high sample-throughput (40 samples per h), better repeatability (relative standard deviation ≤ 1.4%), etc.