Bcl-2阻害剤とAZD9291との相乗効果でH1975細胞におけるAZD9291の後天的抵抗性の克服に成功

Synergistic effects of Bcl-2 inhibitors with AZD9291 on overcoming the acquired resistance of AZD9291 in H1975 cells.

• Zhongwei Liu
• Weimin Gao

抄録

上皮成長因子受容体（EGFR）変異を有する非小細胞肺癌（NSCLC）患者はEGFR-チロシンキナーゼ阻害剤（EGFR-TKIs）で治療可能であるが、後天性抵抗性の発現はEGFR-TKIsの治療効果を著しく制限する可能性がある。第一世代と第二世代のEGFR-TKIに対する後天的耐性のメカニズムの違いは広く報告されているが、オシメルチニブ（AZD9291）のような第三世代のEGFR-TKIに対する後天的耐性のメカニズムはほとんど報告されていない。本研究では、AZD9291耐性のH1975細胞（H1975AR）では、H1975細胞と比較してBcl-2の有意なアップレギュレーションが認められ、AZD9291に対する後天的耐性の重要な耐性機序を構成している可能性が示唆された。さらに重要なことは、AZD9291とBcl-2阻害剤ABT263(0.25μM)またはABT199(1μM)との相乗効果により、AZD9291の後天的耐性を効果的に克服できることを示したことである。フローサイトメトリー解析の結果、AZD9291+ABT263/ABT199は、AZD9291またはABT263/ABT199を単独で投与した場合と比較して、有意に異なる細胞周期分布を引き起こし、有意に多くのアポトーシスを産生することが示された。さらなるマルチスクリーン／ウェスタンブロット分析は、AZD9291またはABT263／ABT199治療単独と比較して、AZD9291+ABT263／ABT199治療群ではNF-κBが有意にダウンレギュレートされ、AZD9291+ABT263治療群と比較してAZD9291+ABT199ではNF-κBがより有意に減少したことを明らかにした。また、AZD9291+ABT263は、AZD9291またはABT263処置単独と比較して特異的にp21の発現を有意に減少させたのに対し、AZD9291+ABT199は、AZD9291またはABT199処置単独と比較して特異的にSQSTM1およびsavivinの発現を有意に減少させたが、オートファゴソームマーカーLC3-IIの発現を増加させたことも顕著であった。さらに、AZD9291+ABT199の細胞毒性は、オートファジー阻害剤であるクロロキンによって部分的に反転させることができた。これらの結果は、H1975ARにおけるAZD9291との相乗的な細胞毒性を達成するために、ABT263とABT199が異なるシグナル伝達経路を介して働く可能性を示唆している。これらの知見は、Bcl-2阻害剤がEGFR-TKI後天性抵抗性を有するNSCLCを治療するために、EGFR-TKIとの併用療法の有効な選択肢を提供する可能性を示唆している。

Non-small cell lung cancer (NSCLC) patients with epithermal growth factor receptor (EGFR) mutations can be treated with EGFR-tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKIs), however, development of acquired resistance could significantly limit curative effects of EGFR-TKIs. Different mechanisms of acquired resistance to first-generation and second-generation EGFR TKIs have been widely reported, but there were few reports on the resistant mechanism of third-generation EGFR-TKI such as osimertinib (AZD9291). In the present study, significant upregulation of Bcl-2 was found in AZD9291-resistant H1975 cells (H1975AR) compared with H1975, which may constitute an important resistant mechanism of acquired resistance to AZD9291. More importantly, our study showed that synergism between AZD9291 and Bcl-2 inhibitor ABT263 (0.25 μM) or ABT199 (1 μM) could effectively overcome the acquired resistance of AZD9291 in H1975AR in vitro. Flow cytometry analyses demonstrated that AZD9291 + ABT263/ABT199 caused a significantly different cell cycle distribution and produced significantly more apoptosis compared with either AZD9291 or ABT263/ABT199 treatment alone. Further multiscreen/Western blot analyses revealed that NF-κB was significantly downregulated in AZD9291 + ABT263/ABT199 treatment groups compared with AZD9291 or ABT263/ABT199 treatment alone, with a more significant reduction of NF-κB in AZD9291 + ABT199 compared with AZD9291 + ABT263. It is also noticeable that AZD9291 + ABT263 specifically caused a significantly reduced expression of p21 compared with AZD9291 or ABT263 treatment alone while AZD9291 + ABT199 specifically caused significantly reduced expressions of SQSTM1 and survivin, but increased expression of autophagosome marker LC3-II compared with AZD9291 or ABT199 treatment alone. Furthermore, cytotoxicity of AZD9291 + ABT199 could be partially reversed by autophagy inhibitor chloroquine. These results suggest that ABT263 and ABT199 may work through different signaling pathways to achieve synergistic cytotoxicity with AZD9291 in H1975AR. These findings suggest that Bcl-2 inhibitor may provide an effective option in combination therapy with EGFR-TKIs to treat NSCLC with EGFR-TKI acquired resistance.