生細胞におけるカリウムチャネルの安静時のコンフォメーションを環境に敏感な蛍光で識別する

Distinguishing Potassium Channel Resting State Conformations in Live Cells with Environment-Sensitive Fluorescence.

• Sebastian Fletcher-Taylor
• Parashar Thapa
• Rebecka J Sepela
• Rayan Kaakati
• Vladimir Yarov-Yarovoy
• Jon T Sack
• Bruce E Cohen

抄録

イオンチャネルは多形膜タンパク質であり、その高分解能構造から個々の構造のイメージを得ることができ、チャネルの生理学を生み出す複雑で一過性のアロステリックな変化を同定するための出発点となっている。本研究では、環境感受性蛍光体で標識したペプチジルタランチュラ毒素を用いて、電圧依存性のKv2.1チャネルの電圧依存性構造変化をライブセルイメージングし、そのスペクトルシフトにより、チャネルの安静時電圧感知ドメイン（VSD）の電圧依存性構造変化を同定した。我々は、新しい環境感受性の遠赤色蛍光体であるジュロリジンフェノキサゾン(JP)アジドを合成し、それをタランチュラ毒素GxTXに結合させて、膜脱分極時のKv2.1のVSDアロステリィを特徴づける。JPは周囲の極性に固有の応答を持ち、各チャネルの構造を部位特異的に理解することができた。膜電位の関数として発光スペクトルを収集するために電圧クランプ分光法を使用して、我々は、それらが毒素の標識部位、Kv2チャネルの存在、および膜電位の変化に応じて変化することがわかります。蛍光体自体がチャネルと密接に相互作用する高親和性共役体では、発光シフトの中間点はKv2.1ゲート電流の中間点よりも50mV負の値を示した。このことは、トキシン-チャネル界面での実質的な構造変化が初期のゲーティング電荷遷移に関連しており、これらの変化はより脱分極した電位でのVSD運動と協調していないことを示唆している。これらの蛍光プローブを用いることで、電気生理学と相関のある構造変化の研究が可能となり、チャンネルの構造やモデルを生きた細胞膜や生理学的状態の文脈に当てはめることが可能となる。

Ion channels are polymorphic membrane proteins whose high-resolution structures offer images of individual conformations, giving us starting points for identifying the complex and transient allosteric changes that give rise to channel physiology. Here, we report live-cell imaging of voltage-dependent structural changes of voltage-gated Kv2.1 channels using peptidyl tarantula toxins labeled with an environment-sensitive fluorophore, whose spectral shifts enable identification of voltage-dependent conformation changes in the resting voltage sensing domain (VSD) of the channel. We synthesize a new environment-sensitive, far-red fluorophore, julolidine phenoxazone (JP) azide, and conjugate it to tarantula toxin GxTX to characterize Kv2.1 VSD allostery during membrane depolarization. JP has an inherent response to the polarity of its immediate surroundings, offering site-specific structural insight into each channel conformation. Using voltage-clamp spectroscopy to collect emission spectra as a function of membrane potential, we find that they vary with toxin labeling site, the presence of Kv2 channels, and changes in membrane potential. With a high-affinity conjugate in which the fluorophore itself interacts closely with the channel, the emission shift midpoint is 50 mV more negative than the Kv2.1 gating current midpoint. This suggests that substantial conformational changes at the toxin-channel interface are associated with early gating charge transitions and these are not concerted with VSD motions at more depolarized potentials. These fluorescent probes enable study of conformational changes that can be correlated with electrophysiology, putting channel structures and models into a context of live-cell membranes and physiological states.