HIV-1の不活化のためのウイルスタンパク質TatとRevによるCas9の制御

Regulation of Cas9 by viral proteins Tat and Rev for HIV-1 inactivation.

• Moisés Vergara-Mendoza
• Luis E Gomez-Quiroz
• Roxana U Miranda-Labra
• Luis L Fuentes-Romero
• Dámaris P Romero-Rodríguez
• Jonathan González-Ruiz
• Sharik Hernández-Rizo
• Mónica Viveros-Rogel

抄録

HIV-1感染症の治療には複合抗レトロウイルス療法（cART）が大きな効果を発揮しているが、プロウイルスが無傷のまま長生きした細胞が持続することは、ウイルスの根絶や滅菌治療を妨げることになる。CRISPR/Cas9ゲノム編集は、HIV-1ゲノムの根絶や複製防止に有効なツールとなっている。さらに、HIVによるCas9遺伝子の発現制御は、プロウイルスゲノムを不活性化する可能性のある変異を誘導することができ、健康な細胞の完全性を損なう可能性のある非特異的変異の誘導を防ぐことで、遺伝子治療を安全なものにすることができる。本研究では、単離された HIV-1 の LTR、INS、RRE 配列を用いて、HEK293 細胞における Cas9 発現を制御し、tat や rev 制御遺伝子などの HIV-1 保存領域の変異を標的としたガイド RNA（gRNA）を設計した。その結果、Cas9 発現が HIV-1 の Tat および Rev タンパク質によって制御され、遺伝子版の自己制御につながり、HIV-1 の複製を不活性化することで強い抗ウイルス効果を示すことを明らかにした。また、シークエンス解析の結果、マルチプレックス編集によりウイルスゲノムが部分的に切除され（90％の効率）、ウイルスキャプシドタンパク質（CA-p24）は検出されないことが確認された。結論として、自己制御型CRISPR/Cas9システムは、HIV-1感染を排除するための信頼性の高い正確な戦略である可能性があり、その効果は感染細胞に限定されることになる。

While combined antiretroviral therapy (cART) has had a great impact on the treatment of HIV-1 infection, the persistence of long-lived cells with an intact provirus precludes virus eradication and sterilizing cure. CRISPR/Cas9 genome editing has become an efficient tool to eradicate HIV-1 genome or prevent replication. Furthermore, regulation of Cas9 gene expression by HIV can induce mutations that could inactivate the proviral genome, making a gene therapy safe by preventing the induction of non-specific mutations, which could compromise the integrity of healthy cells. In this study, isolated HIV-1 LTR, INS and RRE sequences were used to regulate Cas9 expression in HEK293 cells, and guide RNAs (gRNAs) were designed to target mutations in HIV-1 conserved regions such as tat and rev regulatory genes. We demonstrate that Cas9 expression in our system is controlled by the HIV-1 Tat and Rev proteins, leading to self-regulation of gene edition, and showing a strong antiviral effect by inactivating HIV-1 replication. Sequencing analysis confirmed that viral genome was partially excised by multiplex editing (90% efficiency), and viral capsid protein (CA-p24) was undetectable. In conclusion, the self-regulated CRISPR/Cas9 system may be a reliable and accurate strategy for eliminating HIV-1 infection whose effect will be restricted to infected cells.

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