LOV感光体の細胞内赤外差分分光法は、生きた細胞内で変化した光に対する構造応答を明らかにする

In-cell infrared difference spectroscopy of LOV photoreceptors reveals structural responses to light altered in living cells.

• Lukas Goett-Zink
• Jessica L Klocke
• Lena A K Bögeholz
• Tilman Kottke

抄録

タンパク質は通常、宿主細胞内のものとは大きく異なる、よく定義された緩衝液条件で研究されます。いくつかのケースでは、細胞内環境がメカニズムに影響を与えており、実験では見落とされる可能性がある。本研究では、光受容体や光酵素の光誘起応答の研究に赤外差分分光法を用いて、細胞内赤外差分分光法（ICIRD）を確立し、細菌細胞内の可溶性タンパク質の光誘起応答を調べた。青色光受容体であるアウレオクロームとフォトトロピンの光・酸素・電圧（LOV）ドメインのICIRD分光を行ったところ、特定の二次構造要素の応答が抑制されていることが明らかになり、細胞内環境がLOV光受容体のメカニズム全般に影響を与えていることが示唆された。さらに、細胞内蛍光分光法により、細胞内環境が光誘起フラビン付加体の回復を遅らせることが明らかになった。珪藻類のアウレオクローム1aの基本領域ロイシンジッパー(bZIP)-LOVのセグメント分解ICIRD分光法は、LOVセンサーからbZIPエフェクターへのシグナルの進行が、接続するA'αヘリックスのアンフォールディングとは無関係であることを示した。この逸脱は、クラウディング剤であるウシ血清アルブミンを添加して細胞内環境をエミュレートすることで再現されたが、ショ糖ポリマーでは再現されなかった。我々は、ICIRD分光法は、周囲の条件で生きている細胞内の受容体の構造変化を評価するための非侵襲的でラベルフリーのアプローチであると結論付けた。実証されたように、これらのニアネイティブな応答は、条件の下で確立されたメカニズムから逸脱している可能性があります。

Proteins are usually studied in well-defined buffer conditions, which differ substantially from those within a host cell. In some cases, the intracellular environment has an impact on the mechanism, which might be missed by experiments. Infrared difference spectroscopy previously has been applied to study the light-induced response of photoreceptors and photoenzymes Here, we established the in-cell infrared difference (ICIRD) spectroscopy in the transmission and attenuated total reflection (ATR) configuration to investigate the light-induced response of soluble proteins in living bacterial cells. ICIRD spectroscopy on the light, oxygen, or voltage (LOV) domains of the blue light receptors aureochrome and phototropin revealed a suppression of the response of specific secondary structure elements, indicating that the intracellular environment affects LOV photoreceptor mechanisms in general. Moreover, in-cell fluorescence spectroscopy disclosed that the intracellular environment slows down the recovery of the light-induced flavin adduct. Segment-resolved ICIRD spectroscopy on basic-region leucine zipper (bZIP)-LOV of aureochrome 1a from the diatom indicated a signal progression from the LOV sensor to the bZIP effector independent of unfolding of the connecting A'α-helix, an observation that stood in contrast to results. This deviation was recapitulated by emulating the intracellular environment through addition of the crowding agent bovine serum albumin, but not by sucrose polymers. We conclude that ICIRD spectroscopy is a non-invasive, label-free approach for assessing conformational changes in receptors in living cells at ambient conditions. As demonstrated, these near-native responses may deviate from the mechanisms established under conditions.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.