プログラムされた細胞死タンパク質受容体の細胞外ドメインの組換え発現と精製

Recombinant Expression and Purification of Extracellular Domain of the Programmed Cell Death Protein Receptor.

• Adish Zhansaya
• Mukantayev Kanatbek
• Tursunov Kanat
• Ingirbay Bakhytkali
• Kanayev Darkhan
• Kulyyassov Arman
• Tarlykov Pavel
• Mukanov Kasym
• Ramankulov Yerlan

抄録

背景:

CD28受容体ファミリーの一員であるプログラムされた細胞死タンパク質1（PD-1）は、そのリガンドであるPD-L1またはPD-L2と相互作用することにより、抗腫瘍免疫応答をネガティブに制御することができる。PD-1-PD-L1シグナル伝達経路は、がん組織における免疫応答のダウンレギュレーションに不可欠な役割を果たすチェックポイント機構である。したがって、このシグナル伝達経路を遮断することで、抗腫瘍免疫力が向上し、腫瘍の進行を防ぐことができる可能性がある。

Background: The programmed cell death protein 1 (PD-1), which is a member of the CD28 receptor family, can negatively regulate antitumor immune responses by interacting with its ligands, PD-L1 or PD-L2. The PD-1-PD-L1 signaling pathway is a checkpoint mechanism that plays essential roles in downregulating immune responses in cancerous tissues. Thus, blocking this signaling pathway leads to enhanced antitumor immunity, potentially preventing tumor progression.

方法:

PD-1受容体（rPD-1）の細胞外ドメインを、二段階のポリメラーゼ連鎖反応とPhusion® DNAポリメラーゼを用いてde novoで合成した。合成した遺伝子をpET28発現プラスミドにクローニングし、コンピテントに形質転換した。rPD-1の精製は、HisTrapカラムを用いた金属-アフィニティークロマトグラフィーにより行った。精製した rPD-1 は、SwissProt データベースと Mascot プログラムを用いて、ウエスタンブロッティングと質量分析により特徴付けを行った。

Methods: We synthesized the extracellular domain of the PD-1 receptor (rPD-1) de novo by using a two-step polymerase chain reaction and the Phusion® DNA polymerase. The synthesized gene was cloned into the pET28 expression plasmid and transformed into competent . Purification of rPD-1 was performed by metal-affinity chromatography, using a HisTrap column. Purified rPD-1 was characterized by western blotting and mass spectrometry using the SwissProt database and the Mascot program.

研究成果:

本研究では、500bpサイズのrPD-1を設計・合成し、電気泳動データを解析した。精製したrPD-1の電気泳動データを解析したところ、分子量21kDaのタンパク質が存在することが確認された。SwissProtデータベースとMascotプログラムを用いた質量分析データから、最高得点の配列が出力され、rPD-1に対応していることがわかった。

Results: Designed and synthesized construct of rPD-1 was 500 bp in size. Analysis of the electrophoresis data of purified rPD-1 showed the presence of a protein with a molecular mass of 21 kDa. Mass spectrometry data using the SwissProt database and the Mascot program outputted the highest-scoring sequence to correspond to rPD-1.

結論:

合成された新奇なrPD-1は、抗腫瘍免疫応答を増強するための治療への応用が期待されている。

Conclusion: Synthesized de novo rPD-1 may have potential therapeutic applications in enhancing antitumor immune responses.