使用済み培養液中でのRT-PCRを用いたヒト着床前胚の非侵襲的セクシング。概念実証研究

Noninvasive sexing of human preimplantation embryos using RT-PCR in the spent culture media: A proof-of-concept study.

• Mahnaz Esmaeili
• Masood Bazrgar
• Hamid Gourabi
• Bita Ebrahimi
• Parnaz Borjian Boroujeni
• Mostafa Fakhri

抄録

着床前遺伝子検査（PGT）は、通常、侵襲的なアプローチである生検を必要とする。本研究の目的は、使用済み培養液中の SRY DNA/RNA の存在に基づくポリメラーゼ連鎖反応（PCR）/逆転写酵素PCR（RT-PCR）を用いた着床前胚の性別判定のための非侵襲的アプローチを検討することであった。評価は2つのグループに分けた：第1グループでは、ルーチンPGTボランティアの40個の胚を生検後に個別に培養し、第2グループでは31個の胚を受精後5日目まで個別に培養した。各群をさらに３つのサブグループに分けた。RNA抽出(RE)、核酸(NA)、DNase処理(DT)の3つのサブグループに分けた。ＮＡおよびＤＴサブグループでは、ＤＴおよびＮＡサブグループではＤＮａｓｅ処理の有無にかかわらず、それぞれ培地上で直接ｃＤＮＡ合成を行った。培養液中でのPCR/RT-PCRに基づくセクシングの結果を、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)法によるセクシングの結果と比較した。群１では、すべての検体が正しく診断された。グループ2では，5名の雌の検体が誤診となった．検査の感度、特異度、精度は、REで100%、94.44%、96.88%、DTで100%、81.82%、93.55%、NAで100%、71.43%、85.71%であった。胚生検を行わずに、使用済み胚培養液を用いた着床前交配では、REとDTを含むRNA増幅法の方が信頼性が高いようですが、核酸法のNAではDNA汚染による誤診が最も多かったようです。今回の予備研究では、すべての男性サンプルがすべてのサブグループで正しく診断されたため、培養液を用いた着床前の非侵襲的セッシン グは可能であると思われるが、核酸汚染の原因となるものはすべて慎重に回避しなければならない。

Preimplantation genetic testing (PGT) routinely requires biopsy which is an invasive approach. The aim of this study was to examine a noninvasive approach for sexing of preimplantation embryos using polymerase chain reaction (PCR)/reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) based on the presence of SRY DNA/RNA in the spent culture medium. Two groups were evaluated: in group 1, 40 embryos of routine PGT volunteers were cultured individually after biopsy and in group 2, 31 embryos were cultured individually until Day-5 post-fertilization. Each group was further divided into three subgroups: RNA extraction (RE), nucleic acid (NA) and DNase treated (DT). In the NA and DT subgroups, cDNA synthesis was performed directly on culture medium with or without DNase treatment in DT and NA subgroups, respectively. The results of sexing based on the PCR/RT-PCR in the culture medium, were compared with the results of sexing by fluorescence in situ hybridization (FISH) technique. In group 1, all samples were correctly diagnosed. In group 2, five female samples were misdiagnosed. Test's sensitivity, specificity and accuracy were 100 %, 94.44 % and 96.88 %, in RE, 100 %, 81.82 % and 93.55 % in DT and 100 %, 71.43 % and 85.71 % in NA, respectively. Preimplantation sexing without embryo biopsy, in the spent embryo culture media using RNA amplification based methods including RE and DT seem to be more reliable while nucleic acid based method, NA, led to the highest misdiagnoses probably due to DNA contamination. Since all male samples were correctly diagnosed in all subgroups of this preliminary study, preimplantation noninvasive sexing on culture medium seems feasible, however all sources of nucleic acid contamination must be carefully avoided.

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