ホスホネートハンドルを用いた新たに合成されたタンパク質の探索

Fishing for newly synthesized proteins with phosphonate-handles.

• Fleur Kleinpenning
• Barbara Steigenberger
• Wei Wu
• Albert J R Heck

抄録

バイオオルソゴナルケミストリーは、元のシステムへの影響を最小限に抑えながら生体分子にアフィニティラベルを導入するもので、様々な文脈で広く利用されています。プロテオミクスでは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を用いることで、非常に高い感度と選択性でリン酸化ペプチドの濃縮が可能になります。ここでは、PhosIDと呼ばれるホスホネートハンドルを使用した新しい濃縮戦略において、これらの優れた資産を適応させ、組み合わせています。このアプローチでは、クリック可能なホスホネートハンドルは、アジド-ホモ-アラニン（AHA）への1,3-ジポーラハウゼン環化付加を介してタンパク質に導入され、IMACは、ホスホネート標識ペプチドのために排他的に濃縮するために使用されます。インターフェロンγ（IFNγ）刺激細胞では、PhosIDにより、多数のIFN応答性新規合成タンパク質（NSP）の同定が可能となり、これらのタンパク質の経時的な差異合成をモニターすることができた。これらのデータをまとめると、単一のLC-MS/MSランによる数百のNSPの効率的な分析と定量でPhosIDの優れた性能を検証しています。我々は、刺激に敏感なプロテオームサブセットを研究するための魅力的で代替的なツールとしてPhosIDを想定しています。

Bioorthogonal chemistry introduces affinity-labels into biomolecules with minimal disruption to the original system and is widely applicable in a range of contexts. In proteomics, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) enables enrichment of phosphopeptides with extreme sensitivity and selectivity. Here, we adapt and combine these superb assets in a new enrichment strategy using phosphonate-handles, which we term PhosID. In this approach, click-able phosphonate-handles are introduced into proteins via 1,3-dipolar Huisgen-cycloaddition to azido-homo-alanine (AHA) and IMAC is then used to enrich exclusively for phosphonate-labeled peptides. In interferon-gamma (IFNγ) stimulated cells, PhosID enabled the identification of a large number of IFN responsive newly synthesized proteins (NSPs) whereby we monitored the differential synthesis of these proteins over time. Collectively, these data validate the excellent performance of PhosID with efficient analysis and quantification of hundreds of NSPs by single LC-MS/MS runs. We envision PhosID as an attractive and alternative tool for studying stimuli-sensitive proteome subsets.