CML修飾CMLと熱糖化β-ラクトグロブリンのAGEs受容体への結合は電荷と疎水性によって決定される

Binding of CML-Modified as Well as Heat-Glycated β-lactoglobulin to Receptors for AGEs Is Determined by Charge and Hydrophobicity.

• Hannah E Zenker
• Malgorzata Teodorowicz
• Arifa Ewaz
• R J Joost van Neerven
• Huub F J Savelkoul
• Nicolette W De Jong
• Harry J Wichers
• Kasper A Hettinga

抄録

食事による高度な糖化最終生成物（AGEs）の摂取は、炎症に関連した健康問題と関連しています。Nε-カルボキシメチルリジン（CML）は、加工食品に含まれる最も特徴的なAGEsの一つです。AGEは、抗原提示細胞上に存在する受容体のリガンドとして記述されてきました。しかし、タンパク質の二次構造や三次構造の変化もAGE受容体への結合を誘導する。我々は、AGE受容体への結合における異なるタンパク質修飾の役割を識別することを目的としています。したがって、β-ラクトグロブリンをグリオキシル酸で化学修飾してＣＭＬを生成し、乳糖で糖化したβ-ラクトグロブリンと比較した。二次構造は円二色性でモニターし、疎水性とβシート構造の形成はそれぞれANSアッセイとThTアッセイで測定した。凝集は、ネイティブPAGEを用いてモニターした。sRAGE、CD36およびガレクチン-3への結合は阻害ELISAを用いて測定した。試験したすべてのサンプルにおいて二次構造の変化が観察されなかったにもかかわらず、AGE受容体への結合は、CML修飾β-ラクトグロブリンのCML濃度とともに増加した。CMLの負電荷は、タンパク質結合したCMLの結合に決定的な決定因子であり、一方、糖化BLGの結合は、疎水性の増加によって決定された。このことは、sRAGE、ガレクチン-3、およびCD36がタンパク質結合CMLに結合することを示し、AGE受容体への結合における負に帯電したAGEの役割を指摘している。

Intake of dietary advanced glycation end products (AGEs) is associated with inflammation-related health problems. Nε-carboxymethyl lysine (CML) is one of the best characterised AGEs in processed food. AGEs have been described as ligands for receptors present on antigen presenting cells. However, changes in protein secondary and tertiary structure also induce binding to AGE receptors. We aimed to discriminate the role of different protein modifications in binding to AGE receptors. Therefore, β-lactoglobulin was chemically modified with glyoxylic acid to produce CML and compared to β-lactoglobulin glycated with lactose. Secondary structure was monitored with circular dichroism, while hydrophobicity and formation of β-sheet structures was measured with ANS-assay and ThT-assay, respectively. Aggregation was monitored using native-PAGE. Binding to sRAGE, CD36, and galectin-3 was measured using inhibition ELISA. Even though no changes in secondary structure were observed in all tested samples, binding to AGE receptors increased with CML concentration of CML-modified β-lactoglobulin. The negative charge of CML was a crucial determinant for the binding of protein bound CML, while binding of glycated BLG was determined by increasing hydrophobicity. This shows that sRAGE, galectin-3, and CD36 bind to protein bound CML and points out the role of negatively charged AGEs in binding to AGE receptors.