間欠的な低温刺激の筋におけるCREBとその標的遺伝子への影響：局所凍結療法の分子機構の解明

Influence of Intermittent Cold Stimulations on CREB and Its Targeting Genes in Muscle: Investigations into Molecular Mechanisms of Local Cryotherapy.

• Takehito Sugasawa
• Yoshiya Tome
• Yoshinori Takeuchi
• Yasuko Yoshida
• Naoya Yahagi
• Rahul Sharma
• Yuichi Aita
• Haruna Ueda
• Reina Maruyama
• Kaoru Takeuchi
• Shohei Morita
• Yasushi Kawamai
• Kazuhiro Takekoshi

抄録

局所凍結療法は、スポーツ関連の骨格筋損傷の治療法として広く用いられている。しかし、その分子機構は不明である。これらのメカニズムを明らかにするために、我々は様々な細胞株（in vitro）、前脛骨筋（ex vivo）、マウス四肢（in vivo）に4℃で1～3回15分間の低温刺激を行った。インビトロアッセイでは、サイクリックAMP（cAMP）応答エレメント結合タンパク質1（CREB1）が顕著にリン酸化され（p-CREB1）、CREB結合タンパク質（CBP）が2回または3回の低温刺激に応答してp-CREB-1にリクルートされた。cAMP応答性エレメントを用いたレポーターアッセイでは、4℃での2〜3回の低温刺激後にシグナルが有意に増加した。ex vivo実験では、CREBを標的とする遺伝子は、2〜3回の低温刺激後に有意にアップレギュレートされた。in vivo実験では、マウス四肢を9日間低温刺激すると、ミトコンドリアDNAコピー数が有意に増加し、ミトコンドリアの生合成に関与する遺伝子がアップレギュレートされたことが開示された。この結果は、低温刺激の頻度と持続時間に依存する方法で、局所凍結療法がCREBの転写を増加させ、CREBを標的とする遺伝子をアップレギュレートすることを示唆している。この情報は、スポーツ関連骨格筋外傷の治療法としての局所凍結療法のさらなる研究に役立つであろう。

Local cryotherapy is widely used as a treatment for sports-related skeletal muscle injuries. The molecular mechanisms are unknown. To clarify these mechanisms, we applied one to three 15-min cold stimulations at 4 °C to various cell lines (in vitro), the tibialis anterior (TA) muscle (ex vivo), and mouse limbs (in vivo). In the in vitro assay, cyclic AMP (cAMP) response element binding protein 1 (CREB1) was markedly phosphorylated (p-CREB1), and the CREB-binding protein (CBP) was recruited to p-CREB-1 in response to two or three cold stimulations. In a reporter assay with the cAMP-responsive element, the signals significantly increased after two to three cold stimulations at 4 °C. In the ex vivo study, CREB-targeting genes were significantly upregulated following two or three cold stimulations. The in vivo experiment disclosed that cold stimulation of a mouse limb for 9 days significantly increased mitochondrial DNA copy number and upregulated genes involved in mitochondrial biogenesis. The results suggest that local cryotherapy increases CREB transcription and upregulates CREB-targeting genes, in a manner dependent on cold stimulation frequency and duration. This information will inform further investigations into local cryotherapy as a treatment for sports-related skeletal muscle trauma.