細胞培養における SARS-CoV-2 の増殖をモニタリングするための簡便な Q-RT-PCR アッセイ

A facile Q-RT-PCR assay for monitoring SARS-CoV-2 growth in cell culture.

• Christian Shema Mugisha
• Hung R Vuong
• Maritza Puray-Chavez
• Sebla Bulent Kutluay

抄録

現在進行中の COVID-19 パンデミックの病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、わずか数ヶ月の間に数百万人に感染し、膨大な呼吸器疾患と死亡率を引き起こして世界中に広がり続けています。SARS-CoV-2の増殖をモニターするためのアッセイは、時間とコストのかかるRNA抽出ステップに依存しており、基礎研究や薬剤開発の進展を妨げている。ここで我々は、ウイルス RNA 抽出ステップを省略し、少量の細胞培養上清から SARS-CoV-2 の複製速度をモニターできる簡便な Q-RT-PCR アッセイを開発した。このアッセイ法を用いて、我々は概念実証研究において、多数のSARS-CoV-2およびHIV-1特異的阻害剤の活性をスクリーニングしました。細胞プロテアーゼによるウイルススパイク蛋白質の処理とエンドソーム融合が侵入に必要であることを示した先行研究に沿って、E64Dとアピリモドは細胞毒性を最小限に抑えながら細胞培養上清中のSARS-CoV-2 RNA量を強力に減少させることを見いだした。驚くべきことに、マクロピノサイトーシス阻害剤であるEIPAも同様に上清中のウイルスRNAを減少させた。HIV-1特異的阻害薬であるネビラピン（NNRTI），アムプレナビル（プロテアーゼ阻害薬），ALLINI-2（アロステリックインテグラーゼ阻害薬）はSARS-CoV-2の複製を適度に阻害したが，そのIC値はHIV-1に必要な値よりもはるかに高かった。以上のことから、この簡便なアッセイは、SARS-CoV-2の基礎研究を加速させ、SARS-CoV-2の化学的阻害剤を同定するためのミッドスループットのスクリーニングに適しており、幅広い数のRNAおよびDNAウイルスに適用可能であることは間違いない。

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), the etiological agent of the ongoing COVID-19 pandemic, has infected millions within just a few months and is continuing to spread around the globe causing immense respiratory disease and mortality. Assays to monitor SARS-CoV-2 growth depend on time-consuming and costly RNA extraction steps, hampering progress in basic research and drug development efforts. Here we developed a facile Q-RT-PCR assay that bypasses viral RNA extraction steps and can monitor SARS-CoV-2 replication kinetics from a small amount of cell culture supernatants. Using this assay, we screened the activities of a number of entry, SARS-CoV-2- and HIV-1-specific inhibitors in a proof of concept study. In line with previous studies which has shown that processing of the viral Spike protein by cellular proteases and endosomal fusion are required for entry, we found that E64D and apilimod potently decreased the amount of SARS-CoV-2 RNA in cell culture supernatants with minimal cytotoxicity. Surprisingly, we found that macropinocytosis inhibitor EIPA similarly decreased viral RNA in supernatants suggesting that entry may additionally be mediated by an alternative pathway. HIV-1-specific inhibitors nevirapine (an NNRTI), amprenavir (a protease inhibitor), and ALLINI-2 (an allosteric integrase inhibitor) modestly inhibited SARS-CoV-2 replication, albeit the IC values were much higher than that required for HIV-1. Taken together, this facile assay will undoubtedly expedite basic SARS-CoV-2 research, be amenable to mid-throughput screens to identify chemical inhibitors of SARS-CoV-2, and be applicable to a broad number of RNA and DNA viruses.