miR-218、NF-kB、MMP-9、およびTIMP-1の発現に対するシアル酸の効果

The Effect of Sialic Acid on the Expression of miR-218, NF-kB, MMP-9, and TIMP-1.

• Narjes Khatoun Shabani Sadr
• Mohammad Shafiei
• Hamid Galehdari
• Alireza Khirolah

抄録

シアル酸（N-アセチルニューラミン酸、NANA）は脊椎動物のすべての細胞表面に存在する。シアル酸は神経伝達、配糖体の構造、シナプス形成現象に重要な役割を果たし、脳の発達に欠かせない基質であることは広く知られているが、シアル酸濃度の上昇と神経変性の有病率についての報告もある。マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）や組織阻害剤（TIMP）は神経炎症障害に関与し、活性化T細胞、マクロファージ、神経細胞、アストロサイト、ミクログリア細胞など多くの細胞型で産生されている。シアル酸は、その下流の標的として未発見の幅広い神経変性因子の調節に重要な役割を果たしている可能性があると考えられています。本研究では、ヒト脳アストロサイトーマ（グリア細胞）由来のヒト C118 細胞株を用いて、シアル酸溶液曝露が miR-218、NF-kB、MMP-9、TIMP-1 の発現パターンに及ぼす影響を初めて解析しました。MMP-9については、タンパク質の発現量も調べた。NANAの半最大阻害濃度(IC)値はMTTアッセイにより求めた。グリア細胞株をシアル酸（300, 500, 1000μg/ml）で24時間処理し、miR-218, NF-kB, MMP-9, TIMP-1遺伝子の発現に及ぼすリガンドの影響を調べた。タンパク質レベルはウエスタンブロットで確認し、ザイモグラフィーを用いて、条件付培地に分泌されたMMP-9のゲル化分解活性を測定した。300µM, 500µM, 1000µM のシアル酸処理では miR-218 の発現が低下し、その後、NF-kB, MMP-9, TIMP-1 遺伝子およびそれらのタンパク質発現が上昇した。さらに興味深いことに、分泌されたMMP-9の酵素活性も上昇した（p値≦0.05）。本研究は、シアル酸がmiR-218、NF-kB、MMP-9、TIMP-1の遺伝子発現、タンパク質発現、分泌MMP-9の酵素活性に有意な効果を示したことを示している。以上のことから、本研究で得られた情報は、グリア細胞株における神経炎症遺伝子の制御にシアル酸種が関与している可能性を示唆するものである。

Sialic acid (N-acetylneuraminic acid, NANA) is found at all cell surfaces of vertebrates. Although it is widely accepted that sialic acid is an essential substrate for brain development via a significant role in nerve transfers, structure of glycosides, and synaptogenesis phenomena, there are some reports on the elevated levels of sialic acid and prevalence of neurodegeneration. Matrix metalloproteases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) are involved in neuroinflammation disorders and produced by many cell types, including activated T cells, macrophages, neurons, astrocytes, and microglial cells. It can be hypothesized that sialic acid may have a potentially critical role in regulation of a wide range of uncovered neurodegeneration factors as its downstream targets. In this study, for the first time, we aimed to analyze the possible effect of the sialic acid solution exposure in the human C118 cell line, which was derived from a human brain astrocytoma (glial cells), on the expression patterns of miR-218, NF-kB, MMP-9, and TIMP-1. For MMP-9, protein levels were studied too. Half maximal inhibitory concentration (IC) value of NANA was obtained by MTT assay. Glial cell line was treated with sialic acid (300, 500, and 1000 µg/ml) for 24 h to investigate the effects of this ligand on the expression of miR-218, NF-kB, MMP-9, and TIMP-1 genes. Protein levels were checked by Western blotting, and by using zymography, the gelatinolytic activity of MMP-9 secreted into conditioned media was assayed. At 300 µM, 500 µM, and 1000 µM sialic acid treatments, the expression of miR-218 was downregulated; subsequently, the NF-kB, MMP-9, and TIMP-1 genes as well as their protein expressions were upregulated. More interestingly, the enzyme activity of secreted MMP-9 was upregulated too (p-values ≤ 0.05). This study could demonstrate the significant effect of sialic acid on miR-218, NF-kB, MMP-9 , and TIMP-1 expressions in gene and protein levels and also the levels of enzyme activity of secreted MMP-9. Therefore, provided information indicates the novel idea of a possible linkage between sialic acid species and regulation of these neuroinflammation genes in Glial cell line.