マイクロ流体式流体力学的トラップ装置を用いたエクソソソームの精製と解析

Exosome Purification and Analysis Using a Facile Microfluidic Hydrodynamic Trapping Device.

• Mahnoush Tayebi
• Yinning Zhou
• Pallavi Tripathi
• Rajesh Chandramohanadas
• Ye Ai

抄録

エクソソソームは、様々な細胞タイプから分泌されるナノサイズ（30～150 nm）の細胞外小胞（EV）です。エクソソソームは、体液中で容易にアクセスでき、特定の疾患バイオマーカーを含んでいるため、診断や予後のアプリケーションにとって魅力的なものとなっています。エクソソソームの正確な生物学的特徴付けは、エクソソームの亜集団の効果的かつ正確な分離を必要とする臨床応用に向けた重要なステップである。そのため、異種細胞外液からエキソソームを単離するための効率的で信頼性の高いエキソソーム精製技術を開発することが特に重要である。本研究では、アフィニティベースの方法とパッシブマイクロ流体粒子トラップを組み合わせることで、エキソソソームを単離し、可視化することを目的としています。直径20μmのマイクロビーズをストレプトアビジンとビオチン化抗体で機能化し、抗原抗体親和性結合を利用してエクソソソームを表面に固定化・濃縮する。我々は、受動的流体力学的トラップ原理に基づいて、濃縮されたエクソソームを有する多数の個々のマイクロビーズを単一粒子レベル、すなわちトラップ部位ごとに1つの単一ビーズで効率的にトラップするためのトラップアレイを備えたマイクロ流体デバイスを開発しました。大規模なマイクロ流体シングルビーズトラップは、個々のビーズの蛍光検出と定量を大量に多重化することができ、バックグラウンドノイズの光学的干渉を防ぐだけでなく、正確な蛍光ベースのエクソソーム定量のための単一ビーズの平均蛍光密度を取得することができます。さらに、捕捉されたエキソソームのタンパク質およびRNA含有量のオンチップ溶出および溶解により、ウエスタンブロットや定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含むエキソソームのさらなる分子解析が可能になります。このマイクロ流体デバイスは、様々な生物学的研究やアプリケーションのためにEVを分析するための迅速かつ簡単なキャプチャーと定量方法を提供します。

Exosomes are nanosized (30-150 nm) extracellular vesicles (EVs) secreted by various cell types. They are easily accessible in biological fluids and contain specific disease biomarkers, making them attractive for diagnosis and prognosis applications. Accurate biological characterization of exosomes is an important step toward clinical applications that require effective and precise isolation of subpopulations of exosomes. It is therefore of particular importance to develop an efficient and reliable exosome purification technique to isolate exosomes from the heterogeneous extracellular fluids. In this work, we intend to isolate and visualize exosomes by combining an affinity-based method and passive microfluidic particle trapping. Microbeads with a diameter of 20 μm are first functionalized with streptavidin and biotinylated antibodies and then used to immobilize and enrich exosomes on their surfaces using antigen-antibody affinity binding. We have developed a microfluidic device with trapping arrays to efficiently trap a large number of individual microbeads with enriched exosomes at the single-particle level, i.e., one single bead per trapping site, on the basis of a passive hydrodynamic trapping principle. The large-scale microfluidic single-bead trapping permits massively multiplexed fluorescence detection and quantification of the individual beads, which prevents the optical interfering of background noise as well as allowing one to acquire an average fluorescence density of a single bead for an accurate fluorescence-based exosome quantification. In addition, on-chip elusion and lysis of the protein and RNA content of captured exosomes enable further molecular analysis of exosomes, including Western blot and quantitative polymerase chain reaction. This microfluidic device provides a rapid and straightforward capturing and quantification method to analyze EVs for a variety of biological studies and applications.