モノクローナル抗体治療薬における翻訳後修飾および分解をモニターするためのラマン分光法。

Raman Spectroscopy to Monitor Post-translational Modifications and Degradation in Monoclonal Antibody Therapeutics.

• Bethan S McAvan
• Leo A Bowsher
• Thomas Powell
• John O'Hara
• Mariangela Spitali
• Royston Goodacre
• Andrew J Doig

抄録

モノクローナル抗体（mAb）は、バイオ医薬品の市場が急速に拡大していることを表しています。mAbの構造変化は、望まない免疫原性、有効性の低下、製造中の材料の損失につながる可能性があります。製薬業界では、迅速かつin situで製造プロセスに適用できる新しいタンパク質特性評価ツールが必要とされています。ラマンは、情報量が豊富で、侵襲性が低く、水の影響を受けにくく、サンプル前処理がほとんど必要ないことから、この用途に適した技術として注目されています。本研究では、mAbsに見られる翻訳後修飾（PTM）と分解を検出するためのラマンの適用性を調査しています。IgG4分子は、様々なpH、温度、攪拌、光および化学的ストレスを含む、治療薬の分解をもたらすことが知られている様々な条件でインキュベートされています。凝集はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定し、PTMレベルはペプチドマッピングを用いて計算しました。主成分分析（PCA）とラマン分光法および円二色性（CD）分光法による構造解析を組み合わせることで、PTMと分解に基づいてタンパク質を分離することができました。さらに、PCA分離につながるキーバンドを特定することで、スペクトルピークを特定のPTMと相関させることができました。特に、Trp酸化のレベルが高いサンプルでシフトを示すピークを同定しました。IgG4の凝集体をサイズ別に分離することで、特定の官能基のピーク波数と凝集体の量の間に直線的な相関があることを示しました。したがって、我々は、ラマン分光法が、治療法の生産に沿って分解とPTMを測定するための分析ツールとして使用する能力を実証しています。

Monoclonal antibodies (mAbs) represent a rapidly expanding market for biotherapeutics. Structural changes in the mAb can lead to unwanted immunogenicity, reduced efficacy and loss of material during production. The pharmaceutical sector requires new protein characterisation tools that are fast, applicable in situ and to the manufacturing process. Raman has been highlighted as a technique to suit this application as it is information rich, minimally invasive, insensitive to water background and requires little to no sample preparation. This study investigates the applicability of Raman to detect Post-Translational Modifications (PTMs) and degradation seen in mAbs. IgG4 molecules have been incubated under a range of conditions known to result in degradation of the therapeutic including varied pH, temperature, agitation, photo and chemical stresses. Aggregation was measured using size-exclusion chromatography and PTM levels were calculated using peptide mapping. By combining principal component analysis (PCA) with Raman spectroscopy and circular dichroism (CD) spectroscopy structural analysis we were able to separate proteins based on PTMs and degradation. Furthermore, by identifying key bands that lead to the PCA separation we could correlate spectral peaks to specific PTMs. In particular, we have identified a peak which exhibits a shift in samples with higher levels of Trp oxidation. Through separation of IgG4 aggregates, by size, we have shown a linear correlation between peak wavenumbers of specific functional groups and amount of aggregate present. We therefore demonstrate the capability for Raman spectroscopy to be used as an analytical tool to measure degradation and PTMs in-line with therapeutic production.