RNA-seqトランスクリプトームプロファイリングを用いた卵巣肺腺癌感染肺組織の参照遺伝子の決定

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J. Virol. Methods.2020 Jun;284:113923. S0166-0934(20)30175-0. doi: 10.1016/j.jviromet.2020.113923.Epub 2020-06-29.

RNA-seqトランスクリプトームプロファイリングを用いた卵巣肺腺癌感染肺組織の参照遺伝子の決定

Determination of reference genes for ovine pulmonary adenocarcinoma infected lung tissues using RNA-seq transcriptome profiling.

Hui Yang
Liang Zhang
Shuying Liu

PMID: 32615131 DOI: 10.1016/j.jviromet.2020.113923.

抄録

ウシ肺腺癌（OPA）は、世界的に発生する肺上皮の腫瘍であり、羊の飼育の発展に深刻な影響を与えている。本研究では、自然感染したOPA個体3名と健常者3名（2～4歳）の肺組織を採取した。トランスクリプトーム解析と参照遺伝子選択のために RNA を抽出した。トランスクリプトーム解析によると、7個の候補参照遺伝子（真核生物の翻訳開始因子1、EIF1；グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素、GAPDH；β-アクチン、ACTB；GABA型A受容体関連タンパク質、GABARAP。活性化転写因子４、ＡＴＦ４；リボソームタンパク質Ｓ１５、ＲＰＳ１５；およびＹ-Ｂｏｘ結合タンパク質１、ＹＢＸ１）は、１キロ塩基当たりの転写物１００万断片マッピング（ＦＰＫＭ）値＞２００を示した。0および平均値の標準誤差（SEM）＜20.0であった。上記参照候補遺伝子の発現は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）とGeNorm、NormFinder、BestKeeperソフトウェアを用いた解析を組み合わせて評価した。その結果を総合的に解析したところ、ACTBが最も発現安定性が高く、次いでEIF1、GABARAPの順であった。また、上記の 3 遺伝子の発現安定性を検証した結果、羊の肺組織において、OPA の影響を受けた 30 の肺組織と 10 の健康な卵巣の肺組織に加えて、上記の 3 遺伝子の発現安定性が確認された。これらの知見は、今後のOPAの腫瘍化メカニズムに関する研究に役立つものと考えられる。

Ovine pulmonary adenocarcinoma (OPA) is a globally occurring tumor of lung epithelium which seriously affects the development of sheep farming. In our research, lung tissues of 3 naturally infected OPA individuals and 3 healthy individuals (2-4 years old) were collected. RNA was extracted for transcriptome analysis and reference gene selection. According to transcriptome analysis, 7 candidate reference genes (eukaryotic translation initiation factor 1, EIF1; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH; beta-actin, ACTB; GABA Type A receptor-associated protein, GABARAP; activating transcription factor 4, ATF4; ribosomal protein S15, RPS15; and Y-Box binding protein 1, YBX1) showed fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped (FPKM) values > 200.0 and standard errors of the means (SEM) < 20.0. Expression of the above candidate reference genes was evaluated by Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) combined with the analysis using GeNorm, NormFinder, and BestKeeper software. Comprehensive analysis of the results showed that ACTB was the most stable one, followed by EIF1 and GABARAP. Then, expression stability of the above three genes were validated, suggesting as suitable reference genes in sheep lung tissue, in additional 30 OPA-affected lung tissues and 10 healthy ovine lung tissues. Finally, our findings will be helpful for the subsequent study on the tumorigenic mechanism of OPA.