渦鞭毛藻Oxyrrhis marinaのプロテオロドプシン：免疫蛍光軽顕微鏡および免疫電子顕微鏡による超微細構造と局在化

The proteorhodopsins of the dinoflagellate Oxyrrhis marina: ultrastructure and localization by immunofluorescence light microscopy and immunoelectron microscopy.

• Erhard Rhiel
• Martin Westermann
• Frank Steiniger
• Christian Hoischen

抄録

Oxyrrhis marinaの少なくとも7つのプロテオロドプシン配列がショ糖密度勾配遠心分離法で得られたバンドで証明され、MS分析により、バンドはほぼ純粋なネイティブプロテオロドプシンで構成されていることが明らかになった(Rhiel et al. 2020)。プロテオロドプシン画分、すなわちバンドＢ２、Ｂ３およびＢ４を透過型電子顕微鏡で観察した。陰性染色により、バンドＢ２は、約６ｎｍの粒子寸法を有するモノマー／オリゴマーのプロテオロドプシンからなる可能性が高いことが明らかになった。陰性染色、凍結破壊、低温透過型電子顕微鏡観察の結果、バンドB3とB4は、小胞状、シート状、カップ状の構造をしており、これらはすべてタンパク質で構成されていると考えられた。高倍率では、リング状のタンパク質凝集体がよく見られた。それらは直径約4nmで、中央に1.5nmの小さな穴がありました。バンドB2、B3、およびB4をプールし、抗血清を上げるために使用しました。免疫電子顕微鏡を用いて、単離された構造体の強いラベリングを行った。ホルムアルデヒド固定化されたオキシリス細胞の免疫蛍光光顕微鏡では、細胞周辺部の強い標識が得られた。細胞内部構造の一部も標識された。凍結融解した細胞を免疫電子顕微鏡で観察したところ、ほとんどの場合、両生類の小胞の膜は細胞周辺部で標識されているが、細胞内部の標識は食物の液胞に由来するようであった。

At least 7 proteorhodopsin sequences of Oxyrrhis marina were recently proven in bands obtained by sucrose density gradient centrifugation, and MS analyses revealed that the bands consisted almost of pure, native proteorhodopsins (Rhiel et al. 2020). The proteorhodopsin fractions, i.e., bands B2, B3, and B4 were subjected to transmission electron microscopy. Negative staining revealed that band B2 consisted most likely of monomeric/oligomeric proteorhodopsins with particle dimensions of about 6 nm. Negative staining, freeze-fracture, and cryo-transmission electron microscopy revealed that bands B3 and B4 consisted of vesicular, sheet-like, and cup-shaped structures which all seemed to be composed of protein. Frequently, ring-like protein aggregates were registered at higher magnifications. They measured about 4 nm in diameter with a tiny hole of 1.5 nm in the middle. The bands B2, B3, and B4 were pooled and used to raise an antiserum. Immunoelectron microscopy resulted in intense labeling of the isolated structures. Immunofluorescence light microscopy of formaldehyde-fixed Oxyrrhis cells resulted in intense labeling of the cell periphery. Some cell internal structures became labeled, too. Immunoelectron microscopy of freeze-fractured cells revealed that most likely the membranes of the amphiesmal vesicles were labeled at the cell periphery, while the cell internal label seemed to originate from the food vacuoles.