低濃度の3-O-メチルグルコースは、凍結保存されたウシ精子の解凍後の回復を改善します

Low concentrations of 3-O-methylglucose improve post thaw recovery in cryopreserved bovine spermatozoa.

• Maajid H Bhat
• Patrick Blondin
• Patrick Vincent
• James D Benson

抄録

多くの研究では、一般的に細胞を保護するために、膜透過性（通常は代謝可能）と膜不透過性糖類の使用を検討しており、凍結保存中に特に精子を保護します。糖類の保護濃度の臨界値は、50mmol/Lから500mmol/Lの間であることが多く、その有効性は、糖類の膜安定化およびガラス形成特性、および凍結中の細胞内および細胞外塩濃度を低下させるコリゲーション効果に起因しています。雄牛の精子を対象とした多くの研究では、浸透性糖と非浸透性糖のどちらも、凍結後の生存率には無視できるほどのプラスの効果があることが実証されています。しかし、最近では、非代謝性糖である3-O-メチルグルコース（3-OMG）は、0.1-0.3mol/Lで肝凍結保存中に肝細胞を保護することが示されました。グルコースは精子中に容易に輸送されるため、我々は3-OMGが雄牛の精子において新たな凍結保護剤となる可能性があると仮説を立てた。ここでは、3-OMGが雄牛精子の解凍後の生存率を向上させることを示す肯定的な結果を示し、この効果はガラス形成能力の向上によるものではない可能性が高いことを示している。特に実験１では、トリス卵黄-グリセロール基質培地に３-ＯＭＧを０ｍｍｏｌ／Ｌから２００ｍｍｏｌ／Ｌのレベルで添加した。4頭の雄牛からの精液を採取し、凍結保存培地のいずれかで希釈し、冷却し、業界標準の慣行に従って凍結した。3-OMGの濃度が25mmol/Lを超えると運動性とミトコンドリア活性に悪影響を及ぼすことがわかった。そこで、8頭の雄牛の精液を用いて、コントロールと比較して、5mmol/L、15mmol/L、および25mmol/Lの3-OMG濃度を評価する実験2では、より低い濃度を探索した。5mmol/Lの3-OMGおよびコントロールでは、15mmol/Lおよび25mmol/Lの3-OMGよりも運動性および進行性が有意に高かったのに対し、5mmol/Lの3-OMGでは、ミトコンドリア活性およびアクロソーム完全性がコントロールの凍結培地よりも有意に良好であった。実験3では、3-OMGの改善された効果がその非代謝性に起因するか、またはコリゲーション効果に起因するかどうかを評価するために、5mmol/Lのグルコース、スクロース、または3-OMGで凍結保存された4頭の雄牛からの精液中の解凍後生存率を比較した。運動性と進行性の運動性は、EYコントロールと同等のグルコースまたはスクロース群と比較して、3-OMGで有意に改善された。結論として、トリス卵黄-グリセロール培地中の3-OMGを5mmol/Lの濃度で投与すると、雄牛精子の融解後の運動性、進行性運動性、生存率が改善されることがわかった。作用機序は解明されていませんが、低濃度で最大の効果が得られるため、細胞内または細胞外ガラス形成能力の向上によるものではないと考えられ、肝細胞で示されたものとは異なる保護機序を示す可能性があります。

A number of studies have explored the use of membrane permeable (usually metabolizable) and membrane impermeable saccharides to protect cells in general, and sperm in particular during cryopreservation. Critical concentrations for protective levels of sugars frequently range between 50 mmol/L and 500 mmol/L, where efficacy is attributed to the sugar's membrane stabilizing and glass forming attributes and colligative effects that reduce intra- and extracellular salt concentrations during freezing. Many studies on bull sperm have demonstrated that both permeating and non-permeating sugars have negligible positive effects on post-thaw viability. Recently, however, a non-metabolizable sugar, 3-O-Methylglucose (3-OMG), was shown to protect hepatocytes during liver cryopreservation at 0.1-0.3 mol/L. Because glucose is readily transported into sperm, we hypothesized that 3-OMG could be a new class of cryoprotectant to explore in bull sperm. Here we present positive results demonstrating that 3-OMG improves post thaw viability in bull sperm, and that this effect is not likely due to improved glass forming capabilities. In particular, in experiment 1, 3-OMG was added to the Tris-egg yolk-glycerol base media at levels from 0 mmol/L to 200 mmol/L. Semen from four bulls was collected and diluted with one of the cryopreservation media, cooled, and frozen following industry standard practices. Motility and mitochondrial activity were negatively impacted when concentration of 3-OMG was more than 25 mmol/L. Therefore, we explored lower concentrations in experiment 2, where semen from eight bulls was used to evaluate concentrations 5 mmol/L, 15 mmol/L and 25 mmol/L of 3-OMG compared with control. Motility and progressive motility in 5 mmol/L 3-OMG and in the control were significantly higher than 15 mmol/L and 25 mmol/L 3-OMG, whereas mitochondrial activity and acrosome integrity in 5 mmol/L 3-OMG were significantly better than the control freezing medium. In experiment 3, to evaluate whether the improved effects of 3-OMG are due to its non-metabolizing property, or due to colligative effects, we compared post-thaw viability in semen from four bulls cryopreserved with 5 mmol/L glucose, sucrose, or 3-OMG. Motility and progressive motility was significantly improved in 3-OMG compared to glucose or sucrose groups which were comparable to the EY control. In conclusion, 3-OMG at a concentration of 5 mmol/L in Tris-egg yolk-glycerol medium improves the post thaw motility, progressive motility and viability of bull sperm. The mechanism of action is not understood but because the efficacy is maximal at low concentrations, it is not likely due to improved intra- or extracellular glass forming abilities and may demonstrate a different protective mechanism than was shown in hepatocytes.

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