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マイクロプレート常磁性ビーズとフィロペプチドミクスに基づいたダブルバレルクロマトグラフィー-タンデム質量分析法による細菌単離株のハイスループットなプロテオタイピング
High-throughput proteotyping of bacterial isolates by double barrel chromatography-tandem mass spectrometry based on microplate paramagnetic beads and phylopeptidomics.
PMID: 32619772 DOI: 10.1016/j.jprot.2020.103887.
抄録
微生物のタンデム質量分析ベースのプロテオタイピングには、全細胞 MALDI-TOF 質量分析に比べていくつかの利点があります。また、細胞溶解やタンパク質の洗浄にSP3常磁性ビーズを使用することで、プロテオタイピングのためのサンプル調製が容易になります。これらの特徴に基づいて、我々は、多種類の細菌のハイスループットなプロテオタイピングのための96ウェルプレートプラットフォームを開発し、テストしてきました。我々は、細菌の負荷の面でプラットフォームの性能を評価し、ウェル間のクロスコンタミネーションを発見しませんでした。同様に、フィロペプチドミクス分析では、微生物の相対的な定量に変化がないことが明らかになった。最後に、我々は、単位時間当たりのスペクトル数を最大化するタンデム質量分析と結合したダブルバレルクロマトグラフィーを使用して、歯科用分離株の大規模なセットの迅速なプロテオタイピングのためのこの新しいフォーマットを適用しました。この方法により、これらの分離株が純粋な菌株なのか混合株なのかを確認し、最も分解された分類学的レベルで微生物を同定することができた。微生物を迅速かつ正確に同定することは医療診断学の臨床上の優先事項であるが，微生物の混合物を含む検体は分析が困難であり，その手順には時間がかかる。タンデム質量分析プロテオタイピングは、既知または未知の微生物の複雑な混合物の迅速な同定を可能にし、各成分のバイオマス比を確立することもできる。ここでは、タンデム質量分析プロテオタイピングのための96ウェルプレートフォーマットで微生物サンプルを準備するための新しいワークフローを説明し、その利点と限界を文書化します。この新しいフォーマットと高効率のダブルバレルLC-MS/MSシステムを組み合わせることで、55時間で96個の分離株のプロテオタイピングが可能であることを実証した。
Tandem mass spectrometry-based proteotyping of microorganisms presents several advantages over whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry: because a larger number of signals are recorded with better accuracy and precision, the approach allows for the identification of microorganisms at more resolved taxonomic levels, and can easily manage complex samples. Additionally, the use of SP3 paramagnetic beads for cell lysis and protein cleanup simplifies sample preparation for proteotyping. Based on these features, we have developed and tested a 96-well plate platform for high-throughput proteotyping of a large variety of bacteria. We evaluated the performance of the platform in terms of bacterial load and found no cross-contamination between wells. Likewise, phylopeptidomics analysis revealed no alteration in the relative quantifications of microorganisms. Finally, we applied this new format for rapid proteotyping of a large set of dental isolates using double-barrel chromatography coupled to tandem mass spectrometry, which maximizes the number of spectra per unit of time. The procedure allowed us to establish whether these isolates were pure strains or mixtures of strains and to identify the microorganisms at the most resolved taxonomic level. SIGNIFICANCE: The rapid and accurate identification of microorganisms is a clinical priority in medical diagnostics; however, specimens containing mixtures of microorganisms are difficult to analyze and the procedure is time-consuming. Tandem mass spectrometry proteotyping allows the fast identification of complex mixtures of microorganisms, known or unknown, and can also establish the biomass ratio of each component. We describe here a new workflow for preparing microbial samples in a 96-well-plate format for tandem mass spectrometry proteotyping and document its advantages and limitations. We demonstrate that this new format coupled to a highly efficient double-barrel LC-MS/MS system allows proteotyping of 96 isolates in 55 h.
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