金属イオンのPCR阻害およびRT-PCR効率への影響

Impact of metal ions on PCR inhibition and RT-PCR efficiency.

• Agnieszka Kuffel
• Alexander Gray
• Niamh Nic Daeid

抄録

金属イオンによる PCR の阻害は、法医学的 DNA 分析のプロセスにおいて重大な課題となる可能性があります。犯罪現場で遭遇する様々な種類の金属イオンで汚染されたサンプルには、弾丸、カートリッジの薬莢、武器（銃やナイフを含む）、金属線や表面などの金属表面からの綿棒、カルシウムを含む骨サンプルなどがあります。金属イオンがDNAの回収、抽出、およびその後の増幅に与える影響の背後にあるメカニズムは完全には解明されていない。本研究では、一般的に遭遇する金属のDNA増幅に対する阻害効果を評価した。試験した9種類の金属のうち、亜鉛、スズ、鉄(II)および銅は、IC50値が1mMを有意に下回る最も強い阻害作用を有することが示された。研究の第二部では、市販されている3種類のDNAポリメラーゼについて、金属阻害に対する感受性を調べた。その結果、KODポリメラーゼがQ5ポリメラーゼやTaqポリメラーゼと比較して最も金属阻害に対する耐性が高いことがわかった。また、カルシウムキレート剤であるエチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'-四酢酸(EGTA)が、PCR反応のカルシウム誘発阻害を反転させる簡単で非破壊的な方法として使用できることを示す。

Inhibition of PCR by metal ions can pose a serious challenge in the process of forensic DNA analysis. Samples contaminated with various types of metal ions encountered at crime scenes include swabs from metal surfaces such as bullets, cartridge casings, weapons (including guns and knives), metal wires and surfaces as well as bone samples which contain calcium. The mechanism behind the impact of metal ions on DNA recovery, extraction and subsequent amplification is not fully understood. In this study, we assessed the inhibitory effects of commonly encountered metals on DNA amplification. Of the nine tested metals, zinc, tin, iron(II) and copper were shown to have the strongest inhibitory properties having IC50 values significantly below 1 mM. In the second part of the study, three commercially available DNA polymerases were tested for their susceptibility to metal inhibition. We found that KOD polymerase was the most resistant to metal inhibition when compared with Q5 and Taq polymerase. We also demonstrate how the calcium chelator ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) can be used as an easy and non-destructive method of reversing calcium-induced inhibition of PCR reactions.