現代の免疫治療薬や生物薬剤学における治療用ペプチドの定量のためのシンプルで迅速なLC-MS/MSおよびCE-MS/MS分析戦略

A simple and rapid LC-MS/MS and CE-MS/MS analytical strategy for the determination of therapeutic peptides in modern immunotherapeutics and biopharmaceutics.

• Juraj Piestansky
• Peter Barath
• Petra Majerova
• Jaroslav Galba
• Peter Mikus
• Branislav Kovacech
• Andrej Kovac

抄録

代謝性疾患、神経変性疾患、炎症性疾患、癌性疾患の現代治療は、最近では免疫療法のアプローチに基づいています。ペプチドコンジュゲートは、より忍容性が高く、低分子ベースの医薬品よりもはるかに特異的である革新的で効果的な治療薬を表している。これらの治療薬の性質と製造プロセスは、その分析を非常に困難なものにしています。ここでは、タンデム質量分析付き超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）およびタンデム質量分析付きキャピラリー電気泳動（ＣＥ-ＭＳ／ＭＳ）のオンライン組み合わせに基づく２つの頑健な分析方法が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を担体タンパク質とするコンジュゲート中の免疫原性合成ペプチド（ペプチド配列ＣＡＤＮＬＨＫＶＶＧＱＳＴ）の迅速な定量のために開発された。ワクチンアジュバントを配合したコンジュゲート - Alhydrogel®（アルヒドロゲル2 %.2%ギ酸を用いた酸加水分解に基づく最終ペプチドコンジュゲートからのペプチドの効果的な非酵素的放出ステップを試験し、実施することに成功しました。提案された方法は ICH ガイドラインに従って検証され、直線性、精度、精度、検出限界（LOD）または定量限界（LOQ）などのパラメータが評価されました。検量線は 1～30μg.mL の範囲内で直線的であり、相関係数は 0.99 以上であった。日内及び日間精度はそれぞれ3.2～8.1 % (UHPLC-MS/MS)、1.6～9.3 % (CE-MS/MS)、3.6～10.3 % (UHPLC-MS/MS)、4.1～10.2 % (CE-MS/MS)であった。回収率はUHPLC-MS/MS法で98.4〜107.4%、CE-MS/MS法で100.3〜103.2%であった。これらの方法は、最新の免疫治療薬や他のバイオ医薬品に含まれる免疫原の定量に有効なツールとなります。

Modern therapy of metabolic, neurodegenerative, inflammation, or cancer diseases is recently based on an immunotherapeutic approach. The peptide conjugates represent innovative and effective therapeutics that are better tolerated and are much more specific than small molecule-based medicines. The nature and manufacturing process of these therapeutics make their analysis very challenging. Here, two robust analytical methods based on an on-line combination of ultra-high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) and capillary electrophoresis with tandem mass spectrometry (CE-MS/MS) were developed for fast determination of immunogenic synthetic peptide (peptide sequence CADNLHKVVGQST) in a conjugate with bovine serum albumin (BSA) as a carrier protein and is a peptide, conjugate formulated with a vaccine adjuvant - Alhydrogel® 2 %. An effective non-enzymatic release step of the peptide from the final peptide conjugate based on acid hydrolysis with the use of 2% formic acid was successfully tested and implemented. The proposed methods were validated according to the ICH guideline and parameters such as linearity, precision, and accuracy, the limit of detection (LOD) or limit of quantification (LOQ) were assessed. Calibration curves were linear within the range of 1-30 μg.mL and the correlation coefficients were higher than 0.99. The intraday and interday precisions were 3.2-8.1 % (UHPLC-MS/MS), 1.6-9.3 % (CE-MS/MS) and 3.6-10.3 % (UHPLC-MS/MS), 4.1-10.2 % (CE-MS/MS), respectively. The recovery ranged in the interval of 98.4-107.4 % for UHPLC-MS/MS method and 100.3-103.2 % for CE-MS/MS method. The presented approaches represent an effective tool for simple, rapid and robust quantification of immunogens in modern immunotherapeutics and other biopharmaceuticals with appropriate peptide sequences.

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