ブドウ球菌性腸管毒素Mはウシ乳腺上皮細胞に炎症と障害を誘発した

Staphylococcal enterotoxin M induced inflammation and impairment of bovine mammary epithelial cells.

• Yanying Zhao
• Junni Tang
• Danru Yang
• Cheng Tang
• Juan Chen

抄録

黄色ブドウ球菌はウシ乳腺炎の主要な病因の一つである。その乳腺上皮細胞への侵入は、乳腺炎の発症に重要なイベントであることが証明されている。しかし、具体的な病原因子は明らかにされていない。黄色ブドウ球菌はしばしば病原性因子を放出して感染を誘発する。最近のいくつかの研究では、ブドウ球菌性腸管毒素Mがウシ乳房炎に関連する腸管毒素遺伝子の中で最も頻度の高い遺伝子の一つであることが報告されています。そこで、本研究では、48時間処理したウシ乳腺上皮細胞株（MAC-T）細胞の炎症および損傷に及ぼすブドウ球菌性エンテロトキシンMの影響を検討した。まず、ブドウ球菌性腸管毒素Ｍタンパク質をＮｉ-ＮＴＡスピンカラム（ＧＥライフサイエンス、ウェストボロー、ＭＡ）で精製した。腫瘍壊死因子-α、ＩＬ-６、および単球化学吸引性タンパク質１（ＭＣＰ-１）の分泌量を、対応するＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を用いて測定した。第二に、細胞の生存率をCell Counting Kit-8（Bioswamp、武漢、中国）を用いて評価し、細胞のアポトーシスパーセンテージを、アネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）／ヨウ化プロピジウム（PI；Beyotime、南京、中国）染色によって決定した。第３に、ＡＴＰ濃度、活性酸素種（ＲＯＳ）発生量、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）放出量を市販のキットを用いてアッセイした後、蛍光プローブＪＣ-１（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を用いてミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）を推定した。最後に、産生細胞間細胞接着分子-1（ICAM-1）、微小管関連タンパク質1A/1B-軽鎖3 I/II（LC3 I/II）、p62（Proteintech, Rosemont, IL）、およびIκBα、カスパーゼ3、ラパマイシンの哺乳類標的のリン酸化をウエスタンブロットにより検出した。その結果、ブドウ球菌性腸管毒素Ｍは上皮細胞の炎症（腫瘍壊死因子-α、ＩＬ-６、ＭＣＰ-１、ＩＣＡＭ-１産生のアップレギュレーション）、ＮＦ-κＢの活性化（ＩκＢαのリン酸化促進）を誘導することがわかった。さらに、ブドウ球菌エンタートキシンMは、細胞壊死（LDH放出促進）、アポトーシス（アネキシンV-FITC/PI染色、酸化ストレス悪化、ΔΨmと細胞内ATP濃度低下、カスパーゼ3活性化）を介してMAC-T細胞を障害したが、オートファジーとは無関係であった（有意ではないがLC3-II増加、p62発現低下、ラパマイシンの哺乳類標的活性化）。これにより、ブドウ球菌性腸管毒素Mは、サイトカイン、ケモカイン、接着分子の産生を亢進させ、ウシ乳腺上皮細胞の炎症性を誘導した。さらに、細胞の生存率を低下させ、細胞の壊死やアポトーシスを開始させることで上皮細胞の機能不全を引き起こした。上皮細胞は炎症反応の調整や乳房組織の保護に重要な役割を果たしていたことから、ブドウ球菌性腸管毒素Mが乳房炎と関連している可能性が示唆された。

Staphylococcus aureus is one of the major etiological pathogens of bovine mastitis. Its invasion into mammary epithelial cells has been proven to be a key event in the pathogenesis of mastitis. However, the specific pathogenic factors have not been clearly identified. Staphylococcus aureus often triggers infections by releasing virulence factor. Recent several studies reported that staphylococcal enterotoxin M was one of the most frequently found enterotoxin genes associated with bovine mastitis. Thus, the effect of staphylococcal enterotoxin M on inflammation and damage of the bovine mammary epithelial bovine mammary gland epithelial cell line (MAC-T) cells with 48 h treatment was explored in the present study. First, staphylococcal enterotoxin M protein was purified by a Ni-NTA spin column (GE Life Science, Westborough, MA). The levels of tumor necrosis factor-α, IL-6, and monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) secretion were measured with the corresponding ELISA kits (R&D Systems, Abingdon, UK). Second, cell viability was assessed with a Cell Counting Kit-8 (Bioswamp, Wuhan, China) and the apoptotic percentage of cells was determined by annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI; Beyotime, Nanjing, China) staining. Third, ATP concentration, reactive oxygen species (ROS) generation and lactate dehydrogenase (LDH) release were assayed with commercial kits, then mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was estimated using fluorescent probe JC-1 (Beyotime). Finally, the production intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1), microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 I/II (LC3 I/II), p62 (Proteintech, Rosemont, IL), and phosphorylation of IκBα, caspase 3, and mammalian target of rapamycin were detected by Western blot. The results showed that staphylococcal enterotoxin M induced inflammation of epithelial cells (upregulating tumor necrosis factor-α, IL-6, MCP-1, and ICAM-1 production) and activated NF-κB (promoting phosphorylation of IκBα). Furthermore, staphylococcal enterotoxin M impaired MAC-T cells via cell necrosis (enhancing LDH release), apoptosis (annexin V-FITC/PI stain, exacerbating oxidative stress, decreasing ΔΨm and intracellular ATP concentration, and activating caspase 3), but independent of autophagy (nonsignificantly increasing LC3-II, decreasing p62 expression, and activating mammalian target of rapamycin). Thereby, staphylococcal enterotoxin M induced the inflammatory property of bovine mammary epithelial cells by boosting cytokine, chemokine, and adhesion molecule production. Furthermore, it caused epithelial cell dysfunction via depressing cell viability and initiating cell necrosis and apoptosis. Because epithelial cells played important roles in orchestrating the inflammatory response and protecting bovine mammary tissue from mastitis, our results indicated that staphylococcal enterotoxin M may be associated with mastitis.

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