遺伝子工学による毛根中の薬剤学的に活性なアビエタンジテルペンの合成を高める

Boosting the Synthesis of Pharmaceutically Active Abietane Diterpenes in Hairy Roots by Engineering the and Genes.

• Maria Carmela Vaccaro
• Mariaevelina Alfieri
• Nunziatina De Tommasi
• Tessa Moses
• Alain Goossens
• Antonietta Leone

抄録

アビエタンジテルペノイド（AD）は、アエチオピノン、1-オキソアエチオピノン、サルビピソン、フェルギノールなど、様々な種の根から合成され、様々な生物学的活性を有することが知られています。我々は、エチオピノンが、乳腺癌MCF7、HeLa、上皮癌、前立腺腺癌PC3、およびヒトメラノーマA375を含むいくつかのヒト腫瘍細胞株に対して有望な細胞毒性活性を有することを示した。これらの化合物の天然由来の含有量が少なく、化学的に低コストで合成できる可能性が限られていることから、これらの化合物が由来するメチレリスリトールリン酸（MEP）経路の遺伝子を標的にして、アビタンジテルペノイドの生産を最適化することが求められていました。ここでは、毛根（HR）におけるこの興味深いクラスの化合物の代謝フラックスを高めるための現在および進行中の取り組みについて報告する。側方ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）競争的ジベレリン経路で作用する -コパリル二リン酸合成酵素遺伝子（ent）をコードする遺伝子をサイレンシングすると、HRs のアエチオピノンやその他の ADs の含有量が増加し、GGPP プールが ADs の蓄積に対する代謝的制約となっていることが間接的に示唆された。このことは、ゲラニル-ゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子を過剰発現させることで確認された。この遺伝子は、アビエタンのジテルペン含量を基底構成レベル以上に有意に 8 倍に増加させ、HRs のエチオピノン蓄積に大きなブースト効果をもたらした。また、CPPS 遺伝子（コパリル二リン酸合成酵素）を過剰発現させることにより、この生合成ステップが、このクラスの化合物の生合成を最適化するための別の潜在的な代謝ターゲットであることを示唆しており、エチオピノンと他の AD 化合物の有意な蓄積が達成されました。しかし、アビエタンジテルペノイドの増加は、有意であるにもかかわらず、2 つの遺伝子を共発現させることにより、2 つの遺伝子を個別に過剰発現させた場合に比べて効果が低かった。一緒に竹を取って、ここで提示された結果は、それらの分子薬理学的標的および潜在的な将来の商業化のより深い理解のための信頼できる量のエチオピノンおよび他のADを収量するために、毛根ベースのプラットフォームの合理的な設計に新規かつ道具的な知識を追加します。

Abietane diterpenoids (ADs), synthesized in the roots of different species, such as aethiopinone, 1-oxoaethiopinone, salvipisone, and ferruginol, have a variety of known biological activities. We have shown that aethiopinone has promising cytotoxic activity against several human tumor cell lines, including the breast adenocarcinoma MCF7, HeLa, epithelial carcinoma, prostate adenocarcinoma PC3, and human melanoma A375. The low content of these compounds in natural sources, and the limited possibility to synthesize them chemically at low cost, prompted us to optimize the production of abietane diterpenoids by targeting genes of the methylerythritol phosphate (MEP) pathway, from which they are derived. Here, we report our current and ongoing efforts to boost the metabolic flux towards this interesting class of compounds in hairy roots (HRs). Silencing the gene encoding the -copalyl-diphosphate synthase gene (ent), acting at the lateral geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) competitive gibberellin route, enhanced the content of aethiopinone and other ADs in HRs, indicating indirectly that the GGPP pool is a metabolic constraint to the accumulation of ADs. This was confirmed by overexpressing the gene geranyl-geranyl diphosphate synthase) which triggered also a significant 8-fold increase of abietane diterpene content above the basal constitutive level, with a major boosting effect on aethiopinone accumulation in HRs. A significant accumulation of aethiopinone and other AD compounds was also achieved by overexpressing the CPPS gene (copalyl diphosphate synthase) pointing to this biosynthetic step as another potential metabolic target for optimizing the biosynthesis of this class of compounds. However, by co-expressing of and genes, albeit significant, the increase of abietane diterpenoids was less effective than that obtained by overexpressing the two genes individually. Taken together, the results presented here add novel and instrumental knowledge to a rational design of a hairy root-based platform to yield reliable amounts of aethiopinone and other ADs for a deeper understanding of their molecular pharmacological targets and potential future commercialization.

Copyright © 2020 Vaccaro, Alfieri, De Tommasi, Moses, Goossens and Leone.