ロテノンは、PI3K/AKT経路を介して、ヌードマウスにおける大腸がん細胞の生存率、運動性、上皮間葉転換および腫瘍形成を抑制する

Rotenone restrains colon cancer cell viability, motility and epithelial‑mesenchymal transition and tumorigenesis in nude mice via the PI3K/AKT pathway.

• Wenbo Xiao
• Yongwei Liu
• Maolin Dai
• Yu Li
• Renqun Peng
• Shuangjiang Yu
• Hao Liu

抄録

天然の疎水性農薬であるロテノンは、様々な癌細胞において抗癌活性を示すことが報告されています。しかし、大腸がん細胞の遊走・浸潤・転移に対するロテノンの作用機序は未だ不明である。本研究では、CC細胞に対するロテノンの細胞毒性をCell Counting Kit-8アッセイで検出し、クローン形成アッセイで確認した。また、CC細胞の浸潤および遊走活性に対するロテノンの影響は、Transwell invasionおよびWound healing assayにより、それぞれインビトロで決定された。さらに、ロテノンが上皮間葉転換（EMT）プロセスに影響を与えているかどうかを明らかにするために、逆転写定量PCR、ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光アッセイを用いてEMTマーカーの発現を検出した。また、ロテノンを単独またはPI3K/AKTシグナル伝達活性化剤と組み合わせて処理した後のCCにおけるPI3K/AKT経路の主要なマーカーの発現レベルをウエスタンブロット法で検出した。最後に、ロテノンのインビボ抗腫瘍効果を、ロテノンを腹腔内注射した皮下異種移植腫瘍モデルで評価した。本研究の結果、ロテノンはCC細胞の細胞毒性を誘導し、濃度が高くなるほど大きな効果が観察され、未処理細胞と比較して細胞増殖を抑制することが示された。インビトロ細胞機能アッセイの結果、ロテノンは未処理細胞と比較してCC細胞の遊走、浸潤、EMTを阻害することが明らかになった。機械的には、ロテノン処理したCC細胞では、未処理細胞と比較して、AKTとmTORのリン酸化レベルがダウンレギュレーションされていた。さらに、AKTとmTORのリン酸化レベルは、PI3K/AKTシグナル伝達活性化因子であるインスリン様成長因子1（IGF-1）によって増加したが、ロテノン処理ではこれが逆転した。また、IGF-1を活性化した細胞の増殖、遊走、浸潤は、ロテノン処理により減少することが確認された。これらの結果から、ロテノンはPI3K/AKT/mTORシグナル伝達経路を阻害することで、CC細胞の増殖と転移能力に影響を与えていることが示唆された。さらに、ロテノンはCCの腫瘍増殖および転移能力を抑制し、異種移植マウスモデルでも確認された。結論として、本研究では、ロテノンがPI3K/AKT/mTORシグナル伝達経路を阻害することにより、CC細胞の生存性、運動性、EMT、転移をインビトロおよびインビボで阻害することが明らかになった。

Rotenone, a natural hydrophobic pesticide, has been reported to display anticancer activity in a variety of cancer cells. However, the mechanism of rotenone on colon cancer (CC) cell migration, invasion and metastasis is still unknown. In the present study, the cytotoxicity of rotenone on CC cells were detected by the Cell Counting Kit‑8 assay and confirmed by clone formation assay. The effects of rotenone on CC cell invasion and migration activity were determined in vitro by Transwell invasion and wound healing assays, respectively. In addition, to reveal whether rotenone affected the epithelial‑mesenchymal‑transition (EMT) process, reverse transcription‑quantitative PCR, western blotting and immunofluorescence assays were used to detect the expression of EMT markers. The expression levels of the key markers of the PI3K/AKT pathway after rotenone treatment alone or in combination with a PI3K/AKT signaling activator in CC were also detected by western blotting. Finally, the in vivo antitumor effects of rotenone were evaluated in a subcutaneous xenotransplant tumor model treated with an intraperitoneal injection of rotenone. The results of the present study demonstrated that rotenone treatment induced CC cell cytotoxicity and greater effects were observed with increasing concentrations and inhibited cell proliferation compared with untreated cells. In vitro cell function assays revealed that rotenone inhibited CC cell migration, invasion and EMT compared with untreated cells. Mechanically, the phosphorylation levels of AKT and mTOR were downregulated in rotenone‑treated CC cells compared with untreated cells. Additionally, AKT and mTOR phosphorylation levels were increased by the PI3K/AKT signaling activator insulin‑like growth factor 1 (IGF‑1), which was reversed by rotenone treatment. The cell function assays confirmed that the IGF‑1‑activated cell proliferation, migration and invasion were decreased by rotenone treatment. These results indicated that rotenone affected CC cell proliferation and metastatic capabilities by inhibiting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. In addition, rotenone inhibited tumor growth and metastatic capability of CC, which was confirmed in a xenograft mouse model. In conclusion, the present study revealed that rotenone inhibited CC cell viability, motility, EMT and metastasis in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.