また、miRNA-328のダウンレギュレーションは、高グルコースおよび低血清条件下でのPIM1およびAKT/mTORシグナル伝達経路を制御することにより、HUVECの血管新生を促進することが明らかになった。

Downregulation of miRNA‑328 promotes the angiogenesis of HUVECs by regulating the PIM1 and AKT/mTOR signaling pathway under high glucose and low serum condition.

• Yan Zou
• Fei Wu
• Qi Liu
• Xian Deng
• Rui Hai
• Xuemei He
• Xiangyu Zhou

抄録

糖尿病（DM）に伴う障害や死亡の主な原因は血管合併症であり、その過程にはmiR-122、miR-24、miR-423など多くのマイクロRNA（miRNA/miR）が関与している。miR-328がDMや心血管疾患を制御していることが報告されているが、HUVECにおけるmiR-328の役割や作用機序は完全には解明されていない。本研究では、miR-328がHUVECsの機能に及ぼす影響の根底にある役割と作用機序を明らかにすることを目的とした。虚血誘発性組織飢餓と組み合わせた高血糖をシミュレートするために、HUVECを25 mmol/lのD-グルコースと2％FBSを含む内皮細胞培地で24時間培養した[高グルコース"Zs_A0"(HG) + 2％FBS群]。HUVECのmiR-328発現量を逆転写定量PCRで検出した。細胞の遊走、細胞毒性、チューブ状構造形成については、それぞれ創傷治癒、Cell Counting Kit-8、チューブ形成アッセイを用いて解析した。miR-328阻害剤を用いたトランスフェクションを行ったところ、HUVECにおいてmiR-328の発現が抑制された。タンパク質の発現量はウエスタンブロット法で測定した。コントロール群と比較して、HG + 2% FBS群では、HUVECの遊走と管状構造形成が減少し、細胞毒性が増加した。また、血管内皮増殖因子のタンパク質発現量も減少し、HG + 2% FBS群では対照群に比べてmiRNA-328の発現量が増加した。しかし、miRNA-328のダウンレギュレーションは前述の効果を逆転させた。さらに、HG + 2% FBS群ではAKTシグナル伝達経路が阻害されていたが、miR-328のダウンレギュレーションによりAKT/mTORシグナル伝達経路が活性化され、AKTシグナル伝達経路阻害剤であるペリフォシンにより阻害されていたことが明らかになった。また、miR-328はPim-1原遺伝子であるセリン/スレオニンキナーゼ"Zs_A0"(PIM1)を介して制御的な役割を果たしていることが、遺伝子予測とウエスタンブロットにより明らかになった。また、miR-328のダウンレギュレーションは、高グルコース低血清条件下でのHUVECにおいて、PIM1の発現を増加させ、AKT/mTORシグナル伝達経路を活性化させることで、血管新生を促進した。

Vascular complications are the primary reason for disability and mortality associated with diabetes mellitus (DM), and numerous microRNAs (miRNAs/miRs) are involved in the process, such as miR‑122, miR‑24 and miR‑423. It has been reported that miR‑328 regulates DM and cardiovascular disease; however, the role and mechanism of action underlying miR‑328 in HUVECs is not completely understood. The present study aimed to investigate the role and mechanism of action underlying the effects of miR‑328 on the functions of HUVECs. To simulate hyperglycemia combined with ischemia‑induced tissue starvation, HUVECs were cultured in endothelial cell medium with 25 mmol/l D‑glucose and 2% FBS for 24 h [high glucose (HG) + 2% FBS group]. HUVEC miR‑328 expression levels were detected by reverse transcription‑quantitative PCR. Cell migration, cytotoxicity and tube‑like structure formation were analyzed using wound healing, Cell Counting Kit‑8 and tube formation assays, respectively. Following transfection with miR‑328 inhibitor, miR‑328 expression was downregulated in HUVECs. Protein expression levels were determined by western blotting. Compared with the control group, the migration and tube‑like structure formation of HUVECs were decreased, and cell cytotoxicity was increased in the HG + 2% FBS group. The protein expression levels of vascular endothelial growth factor were also decreased, and the expression levels of miRNA‑328 in the HG + 2% FBS group were increased compared with the control group. However, miRNA‑328 downregulation reversed the aforementioned effects. Further experiments indicated that the AKT signaling pathway was inhibited in the HG + 2% FBS group; however, miR‑328 downregulation activated the AKT/mTOR signaling pathway, which was blocked by the AKT signaling pathway inhibitor, perifosine. Gene prediction and western blotting demonstrated that miR‑328 displayed a regulatory role via Pim‑1 proto‑oncogene, serine/threonine kinase (PIM1). In conclusion, miR‑328 expression was upregulated and angiogenesis was inhibited when HUVECs were subjected to high glucose and low serum conditions. miR‑328 downregulation enhanced angiogenesis by increasing PIM1 expression and activating the AKT/mTOR signaling pathway in HUVECs under high glucose and low serum conditions.