糸球体腎炎における細胞外DNAの半定量化のための教師付き機械学習

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis.

• Kim Maree O'Sullivan
• Sarah Creed
• Poh-Yi Gan
• Stephen R Holdsworth

抄録

糸球体細胞死は、ミエロペルオキシダーゼ抗好中球細胞質抗体関連血管炎（MPO-AAV）の病理学的特徴です。細胞外デオキシリボ核酸（ｅｃＤＮＡ）は、アポトーシス、壊死、壊死、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）、およびピロプトーシスを含む様々な形態の細胞死の間に放出される。この細胞死の測定は、細胞死の異なる生化学的形態を識別するために必要とされるいくつかの異なるバイオマーカーで時間がかかる。ecDNAの測定は、一般的に、腎障害の代理として血清および尿中で行われており、病理学的障害が発生する実際の標的臓器では行われていない。腎臓のecDNAを調べる上で現在困難なのは、実験的にもアーカイブされたヒト腎臓生検でも、ホルマリン固定パラフィン埋込組織（FFPE）の方法がないことです。このプロトコルでは、FFPE組織（ヒトおよびマウスの両方）のecDNAを染色し、自家蛍光を消光し、一般に公開されているオープンソースのImageJプラグインtrainable Wekaセグメンテーションからの機械学習ツールを使用して、結果として得られる画像のecDNAを測定するために必要な手順の概要を提供します。訓練可能なWekaセグメンテーションは、プログラムがecDNAを分類するために学習する糸球体内のecDNAに適用されます。この分類器は、後続の取得した腎臓画像に適用され、個々の画像の手動アノテーションの必要性を減らすことができます。学習可能なWekaセグメンテーションの適応性は、実験的なマウス抗MPO糸球体腎炎(GN)の腎臓組織でさらに実証されており、抗MPO GNの共通の病理学的寄与者であるNETsとecMPOを同定することができます。この方法は、訓練可能なWekaセグメンテーションプログラムが、健康な正常腎臓組織と病気の腎臓組織との間でecDNAを区別することができる有効性を明確に示す、腎臓組織中のecDNAの客観的な分析を提供します。このプロトコルは、他の臓器のecDNA、NET、およびecMPOを識別するために簡単に適応させることができます。

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.