葉緑体GAPDH-A1へのサリチル酸の結合を解読する

Deciphering the Binding of Salicylic Acid to Chloroplastic GAPDH-A1.

• Igor Pokotylo
• Denis Hellal
• Tahar Bouceba
• Miguel Hernandez-Martinez
• Volodymyr Kravets
• Luis Leitao
• Christophe Espinasse
• Isabelle Kleiner
• Eric Ruelland

抄録

サリチル酸（SA）は植物の病原体に対する応答に不可欠な役割を持っています。サリチル酸はタンパク質との結合を介して防御シグナルを開始します。NPR1 は転写活性化因子であり、SA 結合の主要な標的である。他にも多くのタンパク質がSAに結合することが最近明らかになっている。これらのタンパク質の中には、一次代謝の重要な酵素が含まれています。この事実は、ストレスを受けた植物におけるエネルギーフラックスを制御するSAの能力の背後にあると考えられる。しかし、このような結合の役割やメカニズムについては、まだ情報が乏しいのが現状です。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は、以前にヒトと植物の両方でSAを結合することが実証されています。ここでは、葉緑体グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素（GAPA1）のA1異性体がSAと16.7nMで結合していることを表面プラズモン共鳴実験で明らかにした。さらに、SAがGAPDH活性を阻害することも明らかにした。さらに、SAがGAPDH活性を阻害していることを明らかにした。その結果、SAには2つの結合ポケットが存在することが明らかになった。SAとタンパク質間の複合体を水中でシミュレーションしたところ、溶媒の存在下ではAsn35の周りの表面空洞の1つのポケットのみがSAを効率的に結合することがわかった。インシリコ突然変異誘発とリガンド/タンパク質複合体のシミュレーションにより、SAとGAPA1の結合におけるAsn35とArg81の重要性が指摘された。この重要性は、実験的生化学的アッセイによってさらに裏付けられている。実際、GAPA1のAsn35をGlyに、またはArg81をLeuに変異させると、SAを結合する酵素の能力が強く低下した。全く同じ空洞がGAPA1へのNADP結合に関与している。より正確には、モデル化は、SAが補酵素のピリミジン基が収まる部位にまさに結合することを示唆している。NADHはSAのGAPA1への結合を用量に応じて阻害し、我々のデータを検証した。

Salicylic acid (SA) has an essential role in the responses of plants to pathogens. SA initiates defence signalling via binding to proteins. NPR1 is a transcriptional -activator and a key target of SA binding. Many other proteins have recently been shown to bind SA. Amongst these proteins are important enzymes of primary metabolism. This fact could stand behind SA's ability to control energy fluxes in stressed plants. Nevertheless, only sparse information exists on the role and mechanisms of such binding. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was previously demonstrated to bind SA both in human and plants. Here, we detail that the A1 isomer of chloroplastic glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPA1) from binds SA with a of 16.7 nM, as shown in surface plasmon resonance experiments. Besides, we show that SA inhibits its GAPDH activity in . To gain some insight into the underlying molecular interactions and binding mechanism, we combined in silico molecular docking experiments and molecular dynamics simulations on the free protein and protein-ligand complex. The molecular docking analysis yielded to the identification of two putative binding pockets for SA. A simulation in water of the complex between SA and the protein allowed us to determine that only one pocket-a surface cavity around Asn35-would efficiently bind SA in the presence of solvent. In silico mutagenesis and simulations of the ligand/protein complexes pointed to the importance of Asn35 and Arg81 in the binding of SA to GAPA1. The importance of this is further supported through experimental biochemical assays. Indeed, mutating GAPA1 Asn35 into Gly or Arg81 into Leu strongly diminished the ability of the enzyme to bind SA. The very same cavity is responsible for the NADP binding to GAPA1. More precisely, modelling suggests that SA binds to the very site where the pyrimidine group of the cofactor fits. NADH inhibited in a dose-response manner the binding of SA to GAPA1, validating our data.