哺乳類のDRH-3とは異なり、DRH-1とその短いアイソフォームは核酸依存性ATPアーゼ活性を持たないことが示唆された。

Purification and Characterization of Double-Stranded Nucleic Acid-Dependent ATPase Activities of Tagged Dicer-Related Helicase 1 and its Short Isoform in .

• Taishi Kobayashi
• Takuro Murakami
• Yuu Hirose
• Toshihiko Eki

抄録

ダイサー関連ヘリカーゼ（DRH）はヘリカーゼサブファミリーの一つであり、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I）などの哺乳類のDRHは抗ウイルス免疫に関与している。 DRH-1とDRH-3は、それぞれ抗ウイルス機能と染色体分離に重要な役割を果たしている。DRH-1とDRH-3は、それぞれ抗ウイルス機能や染色体分離に重要な役割を果たしているが、線虫RIG-IホモログであるDRH-1の生化学的研究は行われていない。本研究では、JPred4による二次構造予測により、DRH-1とDRH-3は異なるN末端領域を有しており、DRH-1の200-アミノ酸N末端領域は非常に豊富なαヘリックス構造を形成していることを明らかにした。その結果、DRH-1の調製に適したタグとしてポリヒスチジン(His)-小ユビキチン様修飾因子(SUMO)を同定し、4種類の異なるN末端タグを持つコドン最適化DRH-1の発現と精製を検討した。DRH-1の全長(アイソフォームa)とN末端切断(アイソフォームb)をHis-SUMOタグ付き融合タンパク質として精製した。最後に、2つのHis-SUMOタグ付きDRH-1アイソフォームとHis-タグ付きDRH-3について、核酸依存性ATPアーゼ活性を調べた。その結果、DRH-3はdsRNA依存性ATPアーゼ活性を示した。しかし、タグ付けされたDRH-1アイソフォームと、SUMOプロテアーゼで処理されたタグフリーのDRH-1（アイソフォームa）では、検出可能な2本鎖RNA依存性のATPアーゼ活性は認められなかった。これらの観察は、DRH-1とその短いアイソフォームは、DRH-3と哺乳類のDRHとは異なり、核酸依存性ATPアーゼ活性を持たないか、または貧弱であることを示唆している。

The Dicer-related helicases (DRHs) are members of a helicase subfamily, and mammalian DRHs such as retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I), are involved in antiviral immunity. DRH-1 and DRH-3 play crucial roles in antiviral function and chromosome segregation, respectively. Although intrinsic double-stranded RNA-dependent ATP-hydrolyzing activity has been observed in the recombinant DRH-3 protein prepared from , there are no reports of biochemical studies of the nematode RIG-I homolog DRH-1. In this study, the secondary structure prediction by JPred4 revealed that DRH-1 and DRH-3 had distinct N-terminal regions and that a 200-amino acid N-terminal region of DRH-1 could form a structure very rich in α-helices. We investigated expressions and purifications of a codon-optimized DRH-1 with four different N-terminal tags, identifying poly-histidine (His)-small ubiquitin-like modifier (SUMO) as a suitable tag for DRH-1 preparation. Full-length (isoform a) and a N-terminal truncated (isoform b) of DRH-1 were purified as the His-SUMO-tagged fusion proteins. Finally, the nucleic acid-dependent ATPase activities were investigated for the two His-SUMO-tagged DRH-1 isoforms and His-tagged DRH-3. The tagged DRH-3 exhibited dsRNA-dependent ATPase activity. However, detectable dsRNA dependency of ATPase activities was not found in either isoform of tagged DRH-1 and a tag-free DRH-1 (isoform a) treated with SUMO protease. These observations suggest that DRH-1 and its short isoform have no or poor nucleic acid-dependent ATPase activity, unlike DRH-3 and mammalian DRHs.