CRISPR/Cas9による変異体のノックアウトとiTRAQによるプロテオミクス解析により、エリートイネの抵抗性に関する新たな知見が得られた

Knockout of by CRISPR/Cas9 and iTRAQ-Based Proteomic Analysis of Mutants Revealed New Insights into Resistance in Elite Rice Line.

• Gul Nawaz
• Babar Usman
• Haowen Peng
• Neng Zhao
• Ruizhi Yuan
• Yaoguang Liu
• Rongbai Li

抄録

イネいもち病は、世界的にイネの生産に影響を与える壊滅的な病害である。宿主抵抗性を有する品種の開発が、いもち病管理のための最良の戦略であることが証明されている。イネのいもち病に対する抵抗性を誘導するイネ抵抗性遺伝子（R）がいくつか確認されているが、いもち病の防御反応をもたらすR遺伝子のメカニズムはまだ解明されていない。ここでは、いもち病抵抗性の役割を調べるためにCRISPR/Cas9をベースとした標的突然変異誘発法を用いて変異株を作製し、17株の変異株をT世代で得た。ホモ接合体変異株は、主要な農学的形質に影響を与えることなく、いもち病に対する抵抗性が向上していることが明らかになった。さらに、iTRAQを用いたプロテオミクス解析を用いて、比較プロテオームプロファイリングを採用し、継代のプロテオミクス制御を研究した。その結果、372個のDEPが同定され、そのうちアップレギュレーションされているのは149個、ダウンレギュレーションされているのは223個であった。GO解析の結果、刺激応答、光合成、炭水化物代謝過程、低分子代謝過程に関連するタンパク質がアップレギュレーションされていた。また、DEPの多くは代謝経路、リボソーム、二次代謝産物生合成、炭素代謝経路に関与していた。40Sリボソーム蛋白質S15（P31674）、50Sリボソーム蛋白質L4、L5、L6（Q10NM5、Q9ZST0、Q10L93）、30Sリボソーム蛋白質S5、S9（Q6YU81、Q850W6、Q9XJ28）、コハク酸脱水素酵素（Q9S827）はハブ蛋白質であった。その結果、変異株では、ジャスモン酸(JA)、サリチル酸(SA)、エチレン代謝のシグナル伝達経路に関与する防御機構関連遺伝子の発現レベルがWTと比較して上昇した。これらの結果は、ゲノム編集の基本的な価値を明らかにし、イネの真菌感染回避に関する知見を広げるものである。

Rice blast () is a devastating disease affecting rice production globally. The development of cultivars with host resistance has been proved to be the best strategy for disease management. Several rice-resistance genes (R) have been recognized which induce resistance to blast in rice but R gene-mediated mechanisms resulting in defense response still need to be elucidated. Here, mutant lines generated through CRISPR/Cas9 based targeted mutagenesis to investigate the role of against blast resistance and 17 mutant plants were obtained in T generation with the mutation rate of 66% including 26% bi-allelic, 22% homozygous, 12% heterozygous, and 3% chimeric and 17 T-DNA-free lines in T generation. The homozygous mutant lines revealed enhanced resistance to blast without affecting the major agronomic traits. Furthermore, comparative proteome profiling was adopted to study the succeeding proteomic regulations, using iTRAQ-based proteomic analysis. We identified 372 DEPs, among them 149 up and 223 were down-regulated, respectively. GO analysis revealed that the proteins related to response to stimulus, photosynthesis, carbohydrate metabolic process, and small molecule metabolic process were up-regulated. The most of DEPs were involved in metabolic, ribosomal, secondary metabolites biosynthesis, and carbon metabolism pathways. 40S ribosomal protein S15 (P31674), 50S ribosomal protein L4, L5, L6 (Q10NM5, Q9ZST0, Q10L93), 30S ribosomal protein S5, S9 (Q6YU81, Q850W6, Q9XJ28), and succinate dehydrogenase (Q9S827) were hub-proteins. The expression level of genes related to defense mechanism, involved in signaling pathways of jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and ethylene metabolisms were up-regulated in mutant line after the inoculation of the physiological races of as compared to WT. Our results revealed the fundamental value of genome editing and expand knowledge about fungal infection avoidance in rice.