ニワトリのTリンパ球増殖を評価するためのEdUベースのフローサイトメトリーアッセイ

An EdU-based flow cytometry assay to evaluate chicken T lymphocyte proliferation.

• Karla Lucía F Alvarez
• Astrid Poma-Acevedo
• Manolo Fernández-Sánchez
• Manolo Fernández-Díaz

抄録

背景:

家禽業界では、ニワトリT細胞増殖の定量分析は、薬剤スクリーニング、ワクチン製造、細胞毒性評価などの多くの生物学的応用において重要である。鶏細胞におけるこの免疫学的反応を評価するために、いくつかのアッセイ法が確立されている。しかし、これらのアッセイには、放射性標識の使用（[3H]-チミジンアッセイ）、DNAの変性または消化（BrdU取り込みアッセイ）の必要性、感度の欠如と抗増殖効果の過小評価（MTTアッセイ）、および活性化分子および細胞生存率の低下の変調（CFSEアッセイ）などのいくつかの欠点があります。これらの制限を克服して、EdU増殖アッセイは、in vitroでの細胞増殖に関する研究において、[3H]-チミジン放射性標識と比較して感度が高く、有利であり、T細胞集団の同時同定を可能にする。しかし、フローサイトメトリーでT細胞の増殖を評価するためにニワトリの初代細胞を用いたこのアッセイは確立されていません。

BACKGROUND: In the poultry industry, quantitative analysis of chicken T cell proliferation is important in many biological applications such as drug screening, vaccine production, and cytotoxicity assessment. Several assays have been established to evaluate this immunological response in chicken cells. However, these assays have some disadvantages including use of radioactive labels ([3H]-Thymidine assay), necessity of DNA denaturation or digestion (BrdU incorporation assay), lack of sensitivity and underestimation of anti-proliferative effects (MTT assay), and modulation of activation molecules and cell viability reduction (CFSE assay). Overcoming these limitations, the EdU proliferation assay is sensitive and advantageous compared to [3H]-Thymidine radioactive labels in studies on cell proliferation in vitro and allows simultaneous identification of T cell populations. However, this assay has not been established using primary chicken cells to evaluate T cell proliferation by flow cytometry.

結果:

ここでは、チミジンアナログ（EdU）の組み込みと蛍光アジドとのクリック反応をフローサイトメーターで検出することにより、ニワトリ初代脾臓細胞の増殖を評価するアッセイ法を確立した。また、チミジンアナログ（EdU）の組み込みと免疫染色を組み合わせて、CD4およびCD8増殖T細胞を検出するプロトコールを確立した。ミトゲン（コンカナバリンA）の濃度を増加させて細胞増殖を誘導することにより、我々は、我々のプロトコルは、クリック反応を実行するために使用された試薬の量と品質に欠乏を提示しないことを示す、EdU陽性細胞の直線的な増加を観察した。

RESULTS: Here, we established an assay to evaluate the proliferation of primary chicken splenocytes based on the incorporation of a thymidine analog (EdU) and a click reaction with a fluorescent azide, detected by a flow cytometer. We also established a protocol that combines EdU incorporation and immunostaining to detect CD4 and CD8 proliferating T cells. By inducing cell proliferation with increasing concentrations of a mitogen (Concanavalin A), we observed a linear increase in EdU positive cells, indicating that our protocol does not present any deficiency in the quantity and quality of reagents that were used to perform the click reaction.

結論:

まとめると、CD4 および CD8 鶏 T 細胞の増殖をフローサイトメトリーで評価する信頼性の高いプロトコールを確立した。また、本プロトコールは社内プロトコールであるため、1 サンプルあたりのコストが低く、大量のサンプルを処理する研究室での導入が可能である。

CONCLUSIONS: In summary, we established a reliable protocol to evaluate the proliferation of CD4 and CD8 chicken T cells by flow cytometry. Moreover, as this is an in-house protocol, the cost per sample using this protocol is low, allowing its implementation in laboratories that process a large number of samples.