CRISPR/Cas9媒介カルバペネム耐性腸内細菌科のカルバペネマーゼ遺伝子とプラスミドの硬化

CRISPR/Cas9-mediated carbapenemase genes and plasmids curing in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae.

• Mingju Hao
• Yuzhang He
• Haifang Zhang
• Xiao-Ping Liao
• Ya-Hong Liu
• Jian Sun
• Hong Du
• Barry N Kreiswirth
• Liang Chen

抄録

プラスミドが媒介するカルバペネム耐性との戦いは、カルバペネム耐性腸内細菌（CRE）の制御と普及防止に不可欠である。ここでは、CRISPR/Cas9を介在させた耐性遺伝子とプラスミド硬化が、CREを効果的にカルバペネムに再感作することを実証するための概念実証研究を行った。新規CRISPR/Cas9媒介プラスミド硬化システム（pCasCure）を開発し、様々な臨床用CRE単離株に電気トランスファーした。その結果、pCasCureは、Enterobacteriaceaeの様々な種類のCRE菌と臨床分離株において、94％以上の治癒効率を示した。また，pCasCureは，流行性カルバペネム耐性プラスミドである IncFIIK-pKpQIL，IncN pKp58_N，pOXA-48-like，IncX3プラスミドの複製・分割（pKpQIL内）遺伝子を標的とすることで，効率的に除去できることが示された．しかし、臨床分離された49210株では、硬化遺伝子は対応するpOXA-48様プラスミドを除去することができなかったが、次世代シークエンシングにより、それはCRISPR/Cas9切断部位の外側でISを媒介とした組換えによるものであることが明らかになり、その結果、プラスミドが切断され、硬化を免れた。それにもかかわらず、カルバペネマーゼ遺伝子やプラスミドの硬化は、49210株の切り捨てを含め、カルバペネマーゼに対する感受性を回復させることに成功し、すべての分離株で最小阻害濃度（MIC）が8倍以上に低下した。以上の結果から、CRISPR/Cas9を介在させたカルバペネマーゼ遺伝子とプラスミドの硬化を利用してCREをカルバペネム類に再感作するという概念が確認された。pCasCureを臨床介入に適用できるように最適なデリバリーシステムに統合するためには、さらなる研究が必要である。

Combating plasmid-mediated carbapenem resistance is essential to control and prevent the dissemination of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE). Here we conducted a proof-of-concept study to demonstrate CRISPR/Cas9-mediated resistance gene and plasmid curing can effectively re-sensitize CRE to carbapenems. A novel CRISPR/Cas9-mediated plasmid-curing system (pCasCure) was developed and electrotransferred into various clinical CRE isolates. The results showed that pCasCure can effectively cure , and in various Enterobacteriaceae species of , , , and clinical isolates, with > 94% curing efficiency. In addition, we also demonstrated that pCasCure can efficiently eliminate several epidemic carbapenem-resistant plasmids, including the -harboring IncFIIK-pKpQIL and IncN pKp58_N, -harboring pOXA-48-like, -harboring IncX3 plasmids, by targeting their replication and partitioning ( in pKpQIL) genes. However, curing gene failed to eliminate its corresponding pOXA-48-like plasmid in a clinical isolate 49210, while further next generation sequencing revealed that it was due to IS mediated recombination outside the CRISPR/Cas9 cleavage site, resulting in truncation and therefor escaped plasmid curing. Nevertheless, the curing of carbapenemase genes or plasmids, including the truncation of in 49210, successfully restore their susceptibility to carbapenems, with > 8-fold reduction of minimum inhibitory concentration (MIC) values in all tested isolates. Taken together, our study confirmed the concept of using CRISPR/Cas9-mediated carbapenemase genes and plasmids curing to re-sensitize CRE to carbapenems. Further work is needed to integrate pCasCure in an optimal delivery system to make it applicable for clinical intervention.

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