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シェーグレン症候群におけるアクアポリン5およびムスカリン受容体3レベルの調節に及ぼす紹鴎散()によるcAMP-PKAシグナル伝達経路のメカニズム
Mechanism of cAMP-PKA Signaling Pathway Mediated by Shaoyao Gancao Decoction () on Regulation of Aquaporin 5 and Muscarinic Receptor 3 Levels in Sjögren's Syndrome.
PMID: 32632716 DOI: 10.1007/s11655-020-3205-5.
抄録
目的:
シェーグレン症候群（SS）におけるアクアポリン5（AQP5）およびムスカリン受容体3（M3R）レベルの調節に、漢方薬の紹鴎湯エキス（SGD）が介在するcAMP-PKAシグナル伝達経路のメカニズムを調べる。
OBJECTIVE: To investigate the mechanism of cAMP-PKA signaling pathway mediated by Chinese medicine formula Shaoyao Gancao Decoction (, SGD) on the regulation of aquaporin 5 (AQP5) and muscarinic receptor 3 (M3R) levels in Sjögren's syndrome (SS).
方法:
30匹のマウスのうち、5匹をコントロールとして無作為に選び、他はSSモデルの作成に使用した。モデル化に成功したマウスを無作為に5群（各群n=5）に分け、生理食塩水（8mL/kg）、ピロカルピン（1.4mg/kg）、または低用量、中用量、高用量のSGD（0.14、0.21、0.35g/kg Radix paeoniaeと0.01g/kg Radix glycyrrhizaeをそれぞれ投与）を6週間胃内投与した。ヒト大陰唇腺アキナー細胞をピロカルピンで処理したか、または生理食塩水をプラセボとしてSGDの用量を変えて処理した。マウスの顎下腺の病理組織学的変化を観察するために、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いた。マウスの顎下腺における抗SS抗原A（SS-A）、抗SS抗原B（SS-B）、M3R、α-fodrinの血清レベルを酵素結合免疫吸着アッセイにより測定した。顎下腺におけるAQP5とM3Rの空間的局在を観察するために免疫蛍光染色を行った。逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロットを用いて、各群の顎下腺組織および細胞におけるPKA、cAMP、Epac1、AQP5、M3R、核内因子κB（NF-κB）および腫瘍壊死因子（TNF）-αの発現を検出した。
METHODS: Of the 30 mice, 5 were randomly selected as control, and others were used for creating SS model. After successful modeling, mice were randomly divided into 5 groups (n=5 per group) and intragastrically administered with saline (8 mL/kg), pilocarpine (1.4 mg/kg), or low, medium and high doses SGD (0.14, 0.21, 0.35 g/kg Radix paeoniae with 0.01 g/kg Radix glycyrrhizae, respectively) for 6 weeks. Human labial gland acinar cells were treated with pilocarpine or varying doses of SGD with saline as the placebo. Hematoxylin and eosin staining was used to observe the histopathological changes of the submandibular glands of mice. The serum levels of anti-SS antigen A (SS-A), anti-SS antigen B (SS-B), M3R, and α-fodrin in submandibular glands of mice were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Immunofluorescence staining was used to observe the spatial localization of AQP5 and M3R in acinar cells. Reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blot were used to detect the expressions of PKA, cAMP, Epac1, AQP5, M3R, nuclear factor kappa-B (NF-κB), and tumor necrosis factor (TNF)-α in submandibular gland tissues and cells of each group.
結果:
モデルマウスの免疫後1～6週間の体重、5分間の唾液分泌、30分間の涙の分泌、涙膜の破断時間は正常マウスと比較して減少した（いずれもP＜0.05）が、水分摂取量は増加した（いずれもP＜0.05）。モデル群では、顎下腺の萎縮が認められ、大きさの異なるアキニ、数の減少、緩い配列を伴い、カテーテルの拡張、リンパ球浸潤の程度の違いを伴っていた。SGD群のマウスの状態は改善された。全用量SGD投与群では、AQP5とM3Rの陽性発現が正常群に比べて高く、SS-A、SS-B、α-fodrinの血清レベルは低く、M3Rの発現はモデルやピロカルピン投与群に比べて高かった（いずれもP＜0.05）。また、モデル群やピロカルピン群と比較して、中用量または高用量のSGDを投与したマウスまたは細胞では、NF-κBおよびTNF-αのmRNAおよびタンパク質レベルが低く（すべてP<0.05）、PKA、Epac1、AQP5およびM3Rのレベルが高く（すべてP<0.05）なっていました。
RESULTS: Compared to normal mice, body weight, 5-min salivary secretion, 30-min secretion of tears and breakup time of tear film of model mice decreased at 1-6 weeks after immunization (all P<0.05), whereas water intake increased (all P<0.05). In the model group, glands of the submandibular glands showed atrophy, accompanied by acini of different sizes, decreased numbers and loose arrangement, with catheter dilatation and different degrees of lymphocyte infiltration. Conditions of mice in SGD groups were improved. The positive expression of AQP5 and M3R were higher in the acinar cells treated with all doses SGD compared to the normal group; serum levels of SS-A, SS-B, and α-fodrin were lower, and that of M3R was higher in all doses SGD treated animals than the model or pilocarpine treated ones (all P<0.05). Compared to the model and pilocarpine groups, the mRNA and protein levels of NF-κB and TNF-α were lower in mice or cells treated with medium or high-dose SGD (all P<0.05), while those of PKA, Epac1, AQP5 and M3R were higher (all P<0.05).
結論:
SGDはcAMP-PKAシグナル伝達経路を調節し、AQP5およびM3Rレベルを上昇させることで、SSの症状を改善することができると考えられる。
CONCLUSION: SGD can improve symptoms of SS by regulating the cAMP-PKA signaling pathway and increasing AQP5 and M3R levels.