シロイヌナズナの脂質分析のためのインタクトエンドソームコンパートメントの免疫精製

Immunopurification of Intact Endosomal Compartments for Lipid Analyses in Arabidopsis.

• Yoko Ito
• Magali Grison
• Nicolas Esnay
• Laetitia Fouillen
• Yohann Boutté

抄録

エンドソームは、細胞間のシグナル伝達、発生、環境に対する細胞応答など、様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。エンドソームは、膜内コンパートメントと呼ばれる複雑な膜内コンパートメントの集合体として動的に組織化されており、それ自体が異なるプールやサブポピュレーションにサブコンパートメント化されています。エンドソームのダイナミクスと成熟は、脂質組成の局所的な変更によって駆動されることがますます明らかになってきています。膜脂質の多様性は印象的であり、その恒常性はしばしば異なる脂質クラス間のクロストークを伴います。そのため、エンドソーム膜脂質の生化学的特徴を明らかにすることは、エンドソームの成熟化過程を明らかにすることにつながると考えられています。本研究では、エンドソーム膜コンパートメントを免疫精製することで、初期エンドソームと後期エンドソームを分離し、初期エンドソームのサブポピュレーションを分離することができます。このセクションでは、脂質含有量の分析を目的としたエンドソーム単離のための免疫沈降プロトコールについて説明する。脂質の同定の最初のラインとして、単離されたエンドソームの総脂肪酸とステロール含有量を同定する手順を詳述します。この方法の利点と限界、潜在的な落とし穴や重要なステップについても議論する。

Endosomes play a major role in various cellular processes including cell-cell signaling, development and cellular responses to environment. Endosomes are dynamically organized into a complex set of endomembrane compartments themselves subcompartmentalized in distinct pools or subpopulations. It is increasingly evident that endosome dynamics and maturation is driven by local modification of lipid composition. The diversity of membrane lipids is impressive and their homeostasis often involves crosstalk between distinct lipid classes. Hence, biochemical characterization of endosomal membrane lipidome would clarify the maturation steps of endocytic routes. Immunopurification of intact endomembrane compartments has been employed in recent years to isolate early and late endosomal compartments and can even be used to separate subpopulations of early endosomes. In this section, we will describe the immunoprecipitation protocol to isolate endosomes with the aim to analyze the lipid content. We will detail a procedure to identify the total fatty acid and sterol content of isolated endosomes as a first line of lipid identification. Advantages and limitations of the method will be discussed as well as potential pitfalls and critical steps.