マイクロUHPLC-MS/MS法による血漿中および血小板中のオキシリピンの分析

Micro-UHPLC-MS/MS method for analysis of oxylipins in plasma and platelets.

• Malgorzata Cebo
• Xiaoqing Fu
• Meinrad Gawaz
• Madhumita Chatterjee
• Michael Lämmerhofer

抄録

オキシリピンは細胞のシグナル伝達に重要な役割を果たしており、自己因子やパラクリン因子として作用します。バイオ流体、特に血漿中のオキシリピンの分析については多くの報告があります。しかし、血小板中のオキシリピンは血小板機能や血栓炎症に大きな影響を与えるにもかかわらず、最新の高感度LCMS法を用いて血小板中のオキシリピンを分析した研究は限られた数しかありませんでした。本研究では、表面多孔質粒子(2.7"Zs_202F"μm)キャピラリーカラム(0.5"Zs_202F"mm ID)と微小液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法(μUHPLC-ESI-QqQ-MS/MS)をベースとした新しい分析法を開発し、最適化し、検証した。これは、最終的にヒト血漿と血小板の分析に適用することに成功しました。本法は、重水素化された13種類の内部標準物質と42種類のオキシリピンを正確かつ正確に同時に定量することができます。Bond Elut Certify IIを使用した固相抽出は、良好な抽出回収率を提供します（平均約75%）。μUHPLC-MS/MS法は選択的で感度が高く（LOQは30～150"Zs_202F"pg/mL）、良好な直線性を示します。ほとんどの化合物の検出限界は、カラム上で2から250"Zs_202F"fmolの間です。23種類のオキシリピンが血漿中に、19種類のオキシリピンが非活性化血小板中に検出されました（すべてのサンプルは健康なドナーからのものです）。μUHPLC-MS/MS法は、移動相の使用量が非常に少なく（1回の分析あたりの移動相中の有機溶媒の250"Zs_202F"μL未満）、したがって、環境に優しいと考えられています。また、日常的な分析にも十分な堅牢性を有していることが判明しました。

Oxylipins play an important role in cell signaling and they act as auto- and paracrine factors. There are numerous reports on the analysis of oxylipins in biofluids, especially in plasma. Only a limited number of studies addressed the analysis of oxylipins in platelets using modern, sensitive LCMS methods, even though these compounds have a huge impact on platelet functions and thrombo-inflammation. In this work, a new method based on superficially porous particle (2.7 μm) capillary column (0.5 mm ID) and micro-liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (μUHPLC-ESI-QqQ-MS/MS) method has been developed, optimized and validated. It has finally been successfully applied for human plasma and platelet analysis. The method allows the precise and accurate simultaneous quantification of 42 oxylipins with 13 deuterated internal standards. Solid phase extraction with Bond Elut Certify II provides good extraction recoveries (on average around 75 %). The μUHPLC-MS/MS method is selective, sensitive (LOQs between 30 and 150 pg/mL) and shows good linearity. Limits of detections for most of the compounds are between 2 and 250 fmol on column. Twenty-three oxylipins have been detected in plasma and 19 in non-activated (resting) platelets (all samples were from healthy donors). The μUHPLC-MS/MS method uses very low volume of mobile phase (less than 250 μL of organic solvents in mobile phase per analysis), and therefore is considered environmentally friendly. It also turned out to be robust enough for routine analysis.

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