骨原性分化を誘導するナノメディシンとしての超小型リゾチーム保護金ナノクラスターの開発

Ultra-Small Lysozyme-Protected Gold Nanoclusters as Nanomedicines Inducing Osteogenic Differentiation.

• Kuo Li
• Pengfei Zhuang
• Bailong Tao
• Dan Li
• Xuejiao Xing
• Xifan Mei

抄録

目的:

極小金ナノクラスター（AuNC）は、生体親和性に優れた蛍光ナノ材料として、生体内でのバイオメディカル応用が広く研究されている。しかし、骨粗鬆症治療や骨再生に重要な骨形成分化誘導効果については、これまでほとんど研究されていませんでした。ここでは、リゾチームで保護されたAuNC（Lys-AuNC）を用いて骨形成分化を誘導することで、骨疾患の治療への応用が期待されている。

Purpose: Ultra-small gold nanoclusters (AuNCs), as emerging fluorescent nanomaterials with excellent biocompatibility, have been widely investigated for in vivo biomedical applications. However, their effects in guiding osteogenic differentiation have not been investigated, which are important for osteoporosis therapy and bone regeneration. Herein, for the first time, lysozyme-protected AuNCs (Lys-AuNCs) are used to stimulate osteogenic differentiation, which have the potential for the treatment of bone disease.

方法:

MC3T3E-1 の増殖は骨形成分化に重要である。まず、MC3T3E-1の増殖率をCell Counting Kit-8（CCK8）アッセイで調べました。PI3K/Aktのシグナル伝達経路は、全身の増殖を制御する上で中心的な役割を果たしている。PI3K/Aktの発現は、リゾチームの存在下で、リゾチームで保護されたAuNC(Lys-AuNCs)の発現をウエスタンブロット(WB)と細胞内イメージングにより調べ、骨形成分化機構を退避させた。さらに、破骨細胞（OC）の形成は骨芽細胞の分化に負の役割を果たしていることを明らかにした。核内因子κBリガンド(RANKL)とマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)のシグナル伝達経路を用いて、Raw 264.7細胞株の検討を行い、骨形成分化の負の影響を理解することができた。Raw 264.7（マウスマクロファージ様）細胞とNIH/3T3（マウス線維芽細胞）細胞をチロキサポールで処理し、細胞生存率を評価した。生の264.7細胞は、破骨細胞の形成と機能を理解するためのin vitro研究にも使用されている。誘導された破骨細胞はTRAP共焦点蛍光イメージングにより同定された。これらの破骨細胞形成に重要な因子（NFATc-1, c-Fos, V-ATPase-2, CTSK）をウエスタンブロット法で調べたところ、破骨細胞形成に重要な因子はNFATc-1, c-Fos, V-ATPase-2, CTSKであることがわかった。

Methods: Proliferation of MC3T3E-1 is important for osteogenic differentiation. First, the proliferation rate of MC3T3E-1 was studied by Cell Counting Kit-8 (CCK8) assays. Signaling pathways of PI3K/Akt play central roles in controlling proliferation throughout the body. The expression of PI3K/Akt was investigated in the presence of lysozyme, and lysozyme-protected AuNCs (Lys-AuNCs) by Western blot (WB) and intracellular cell imaging to evacuate the osteogenic differentiation mechanisms. Moreover, the formation of osteoclasts (OC) plays a negative role in the differentiation of osteoblasts. Nuclear factor κB ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) signaling pathways are used to understand the negative influence of the osteogenic differentiation by the investigation of Raw 264.7 cell line. Raw 264.7 (murine macrophage-like) cells and NIH/3T3 (mouse fibroblast) cells were treated with tyloxapol, and the cell viability was assessed. Raw 264.7 cells have also been used for in vitro studies, on understanding the osteoclast formation and function. The induced osteoclasts were identified by TRAP confocal fluorescence imaging. These key factors in osteoclast formation, such as (NFATc-1, c-Fos, V-ATPase-2 and CTSK), were investigated by Western blot.

結果:

以上の検討から、Lys-AuNCsは骨形成分化を促進し、破骨細胞活性を低下させることが明らかになった。また、リゾチーム（保護テンプレート）、AuNPs、またはリゾチームとAuNPsの混合物は、Lys-AuNCsと比較して、骨芽細胞分化にはほとんど影響を与えないことが明らかになった。

Results: Based on the above investigation, Lys-AuNCs were found to promote osteogenic differentiation and decrease osteoclast activity. It is noteworthy that the lysozyme (protected template), AuNPs, or the mixture of Lysozyme and AuNPs have negligible effects on osteoblastic differentiation compared to Lys-AuNCs.

結論:

本研究は、骨形成分化を促進する新しい金ナノ材料の開発に新たな道を開くものである。AuNCをナノメディシンとして骨粗鬆症治療に利用する可能性が期待できる。

Conclusion: This study opens up a novel avenue to develop a new gold nanomaterial for promoting osteogenic differentiation. The possibility of using AuNCs as nanomedicines for the treatment of osteoporosis can be expected.

© 2020 Li et al.