敗血症患者における欠陥好中球機能は、ex vivoでのアスコルビン酸インキュベーションにより大部分が回復した

Defective Neutrophil Function in Patients with Sepsis Is Mostly Restored by ex vivo Ascorbate Incubation.

• Kritsanawan Sae-Khow
• Sasipha Tachaboon
• Helen L Wright
• Steven W Edwards
• Nattachai Srisawat
• Asada Leelahavanichkul
• Direkrit Chiewchengchol

抄録

背景:

好中球機能は細菌感染に対する効果的な防御に不可欠であるが、敗血症患者では欠損している。敗血症患者の血漿中に低いアスコルビン酸またはビタミンCは、ヒトの好中球の内部に貯蔵され、その正常な機能に不可欠である。

Background: Neutrophil function is essential for effective defence against bacterial infections but is defective in patients with sepsis. Ascorbate or vitamin C, which is low in the plasma of patients with sepsis, is stored inside human neutrophils and is essential for their normal function.

目的:

本研究では、アスコルビン酸の生体外投与が敗血症患者の好中球機能を改善するかどうかを明らかにすることを目的とした。

Objective: This study aimed to determine if ascorbate treatment ex vivo improved neutrophil function in patients with sepsis.

患者さんと方法:

ヒト血液中の好中球は、敗血症と20健康な年齢をマッチさせたコントロールを持つ20患者から分離された。好中球は、2hまでの期間のためにアスコルビン酸（1、5、10、20および40 mM）の有無にかかわらずインキュベートした。化学走性は、化学吸引剤であるfMLPに応答して、化学走性チャンバーを用いて評価した。ファゴサイトーシス（pHrodo赤染色の取り込み）とアポトーシス（アネキシンV/ヨウ化プロピジウム染色）をフローサイトメトリーで測定した。好中球細胞外トラップ（NET）形成を検出し、DAPI、抗ミオペルオキシダーゼおよび抗好中球エラスターゼ免疫蛍光染色を用いて定量化した。Quantifluorは、遺伝子の発現の変化を定量PCRで同定しながら、ネット上清中のdsDNAの量を検出した。

Patients and Methods: Human blood neutrophils were isolated from 20 patients with sepsis and 20 healthy age-matched controls. Neutrophils were incubated with or without ascorbate (1, 5, 10, 20 and 40 mM) for periods up to 2h. Chemotaxis was evaluated using a chemotactic chamber in response to the chemoattractant, fMLP. Phagocytosis (uptake of pHrodo red stained ) and apoptosis (annexin-V/propidium iodide staining) were measured by flow cytometry. Neutrophil extracellular trap (NET) formation was detected and quantified using DAPI, anti-myeloperoxidase and anti-neutrophil elastase immuno-fluorescence staining. Quantifluor detected the amount of dsDNA in NET supernatants, while quantitative PCR identified changes in expression of gene.

結果:

敗血症患者ではケモタクチック活性と貪食活性が低下したが、高濃度のアスコルビン酸を投与すると上昇した。アポトーシスは敗血症患者で増加したが、アスコルビン酸処理によって変化しなかった。自発的NET形成は敗血症患者で観察された。アスコルビン酸の高濃度（>10mM）はさらにNET形成を促進しながら、1mMアスコルビン酸の量は、正常な、健康な好中球のそれに自然NETosisを減少させた。

Results: Chemotactic and phagocytic activities were decreased in patients with sepsis but increased after treatment with the high concentrations of ascorbate. Apoptosis was increased in the sepsis patients but not altered by ascorbate treatment. Spontaneous NET formation was observed in patients with sepsis. A quantity of 1mM ascorbate decreased spontaneous NETosis to that of normal, healthy neutrophils, while high concentrations of ascorbate (>10mM) further promoted NET formation.

結論:

敗血症患者では好中球機能の異常が観察され、これが疾患病理と転帰の一因となっている可能性がある。アスコルビン酸を投与することで、これらの機能変化の一部を逆転させることができる可能性がある。これらの新しい発見は、アスコルビン酸塩治療が、敗血症時の好中球機能の改善をもたらす補助療法として使用される可能性を高めている。

Conclusion: Dysregulated neutrophil function was observed in patients with sepsis which could contribute to disease pathology and outcomes. Exposure to ascorbate could reverse some of these changes in function. These novel discoveries raise the possibility that ascorbate treatment could be used as an adjunctive therapy that could result in improved neutrophil function during sepsis.

© 2020 Sae-khow et al.